论文摘要
恶性黑色素瘤起源于黑素细胞,是皮肤癌中侵袭性最强的类型,其最突出的特点是对放化疗的不敏感以及外部刺激可促进肿瘤的进展和转移。全世界恶性黑色素瘤的发病率及病死率不断升高,在美国,每年有近40000恶性黑色素瘤的新发病人,并且有7000人死亡。对于已经发生转移的恶黑仍然没有满意的治疗方法,五年生存率约6%。T-钙粘蛋白与其它已知的钙粘蛋白都不同,它是截短的钙粘蛋白,它的一个独特的特点就是无跨膜区和胞浆区,代之通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol GPI）锚定在细胞膜上。本课题旨在研究T-cadherin对B16F10细胞生长抑制作用的可能机制,以期为临床基因治疗恶性黑色素瘤提供实验依据。目的：本研究以小鼠黑色素瘤B16F10细胞株为研究对象,采用脂质体转染的方法将T-cadherin转入B16F10细胞系,探讨T-cadherin对B16F10细胞株增殖、凋亡的作用及其机制,探讨T-cadherin对B16F10细胞作用的可能机制,并进一步研究其对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响。方法：1.细胞来源：本实验采用的B16F10细胞是一种来源于C57BL/6小鼠的高转移黑色素瘤细胞系。2.稳定转染细胞系的获得：体外培养黑色素瘤细胞株B16F10,当细胞达到90%融合时,加入真核表达载体pEGFP-N1-T-cadherin与LipofectamineTM2000复合物,用G418进行筛选。3.以B16F10细胞株为研究对象,应用RT-PCR法和免疫组化SP法分别从基因水平和蛋白水平对稳定转染的细胞进行鉴定。4.以B16F10细胞株为研究对象,采用MTT法检测各组细胞的增殖情况,应用流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞的周期变化。5.transwell细胞侵袭实验：以B16F10细胞株为研究对象,应用transwell细胞侵袭实验法测定未转染组、pEGFP-N1空载体组和pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的侵袭力。6.数据处理采用SPSS11.5统计学软件进行,采用单因素方差分析和LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1.RT-PCR结果显示扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈明显条带,其大小为208bp。在基因水平证实T-cadherin已成功转染于B16F10细胞。2.免疫组化结果显示未转染组和转染pEGFP-N1空载体组T-cadherin表达均为阴性,转染pEGFP-N1-T-cadherin组呈阳性表达。从蛋白水平证明了T-cadherin已成功转染于B16F10细胞。3.增殖活性检测：pEGFP-N1-T-cadherin组的细胞生长明显受抑。MTT结果显示,pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的OD值为0.383±0.116,远远低于未转染组的1.142±0.053和pEGFP-N1空载体组的1.250±0.055,差异有统计学意义（P<0.05）；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义（P>0.05）。4.流式细胞仪检测AnnexinV-EGFP/PI染色的细胞凋亡情况：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的早期凋亡率为（28.157±3.692）%,远远高于未转染组的（2.893±0.454）%和pEGFP-N1空载体组的（2.350±0.578）%,差异有统计学意义（P<0.05）；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义（P>0.05）。5.流式细胞仪通过亚倍体峰检测PI染色的细胞凋亡情况：流式细胞仪检测细胞凋亡最早使用的是PI法,细胞凋亡后形成凋亡小体,导致细胞的DNA丢失,在流式细胞仪检测的DNA含量图中出现亚倍体峰,即凋亡峰。PI染色法结果显示：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组细胞出现了明显的亚二倍体峰,其凋亡率为（16.063±0.795）%,远远高于未转染组的（0.523±0.140）%和pEGFP-N1空载体组的（0.417±0.087）%,差异有统计学意义（P<0.05）；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义（P>0.05）。6.T-cadherin对恶性黑色素瘤细胞DNA周期的影响：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组细胞的G2/M期细胞比率为（10.790±0.731）%；明显高于未转染组的（1.963±1.145）%和pEGFP-N1空载体组的（1.263±0.459）%,差异有统计学意义（P<0.05）,细胞被阻滞在G2/M期；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义（P>0.05）。7.transwell细胞侵袭实验结果：稳定转染pEGFP-N1-T-cadherin组的穿膜细胞数为2.2±0.490,明显少于未转染组的16.8±1.39和转染pEGFP-N1空载体组的15.0±1.265,差异有统计学意义（P<0.05）；未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义（P>0.05）。 MTT法显示转染pEGFP-N1-T-cadherin组穿膜细胞的OD值为0.124±0.003,明显低于未转染组的0.263±0.006和转染pEGFP-N1空载体组的0.247±0.012,差异有统计学意义（P<0.05）,未转染组与转染pEGFP-N1空载体组差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1.T-cadherin基因通过G2/M期阻滞和诱导细胞凋亡的方式抑制恶性黑色素瘤细胞生长。2.T-cadherin对B16F10细胞的体外侵袭能力有抑制作用。
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