番茄萜类化合物生物合成途径相关酶基因的克隆与分析

论文摘要

植物通过类异戊二烯生物合成途径产生的萜类化合物（terpenoid）,对植物的正常生长发育以及植物与生态环境之间的联系起着重要的作用。萜类化合物具有重要的商业价值以及生态意义,萜类代谢工程成为目前次生代谢工程的研究热点,尤其随着萜类代谢途径以及调控机理的深入研究,以基因工程技术为基础的代谢工程成为提高目标萜类产物的最有潜力的手段之一。然而,萜类代谢途径关键酶基因的克隆与鉴定工作是利用相关酶进行基因操作进而提高植物目标萜类化合物产量的基础。番茄（Solanum lycopersicum）为世界性重要蔬菜作物,进行番茄萜类代谢工程研究具有重要意义,可以通过萜类代谢工程对番茄的品质、风味、抗病、抗虫等性状进行遗传改良。目前,番茄萜类代谢工程已取得一定的研究进展,番茄萜类生物合成途径的一些相关酶基因已被克隆并进行了转基因研究,但还有部分关键基因还未被克隆。因此,本研究以番茄为材料,克隆分析了3个萜类化合物生物合成相关酶基因,丰富并进一步完善了番茄萜类化合物生物合成途径相关酶研究,为利用番茄萜类化合物生物合成途径相关酶进行萜类代谢工程研究奠定基础。本研究主要结果如下:1.以在GenBank搜寻到的烟草（Nicotiana tabacum）异戊烯基焦磷酸异构酶2（IPI2）基因（AB049816）的cDNA为信息探针,在TIGR番茄数据库里BLAST到一条电子拼接序列TC183769,根据该TC克隆出番茄异戊烯基焦磷酸异构酶基因（SlIPI）的cDNA序列,其GenBank登录号为EU253957,测序结果表明,该cDNA全长708bp,编码235个氨基酸,与TC183769的核酸同源性为99%,氨基酸同源性为100%。氨基酸序列比对结果显示番茄IPI与其他植物IPI的同源性非常高。经预测分析该SlIPI不含有叶绿体信号肽,定位于细胞质与过氧化物体;SlIPI含有IPI蛋白质的重要的功能区域—NUDIX domain及活性位点Cys88和Glu149。三维结构模型分析表明,SlIPI与人类（Homo sapines）IPI结构非常相似。通过半定量RT-PCR进行IPI组织表达分析表明SlIPI在植物不同组织中表达水平有差异,在根中表达量最高。原核表达的重组SlIPI蛋白的分子量大小与通过软件预测的分子量大小相同,为27.1KD。在大肠杆菌中超量表达SlIPI,可以推动萜类生物合成代谢流,促进β-胡萝卜素的生物合成,从而验证了SlIPI的功能。2.以在GenBank搜寻到的拟南芥（Arabidopsis thaliana）3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶（HMGS）基因（NM117251）的全长cDNA为信息探针,在TIGR番茄数据库里BLAST到一条电子拼接序列TC176556,根据该TC克隆出番茄3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因（SlHMGS）的cDNA序列,其GenBank登录号为EU253956,测序结果表明,该cDNA全长1389bp,编码462个氨基酸,与TC176556的核酸同源性为99%,氨基酸同源性为99%。氨基酸序列比对结果显示番茄HMGS与其他植物HMGS的同源性较高。SlHMGS系统进化树分析表明,SlHMGS与其他物HMGS具有共同的祖先。MotifScan分析表明SlHMGS含有3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶的活性位点。三维结构模型分析表明,SlHMGS与芥菜（Brassica juncea）HMGS结构相似。原核表达的重组SlHMGS蛋白的分子量大小与通过软件预测的分子量大小相同,为51.08KD。3.以在GenBank搜寻到的橡胶树（Hevea brasiliensis）甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶（MDC）基因（AF429368）的全长cDNA为信息探针,在TIGR番茄数据库里BLAST到一条电子拼接序列TC172759,根据该TC序列克隆出番茄甲瓦龙酸-5-焦磷酸脱羧酶（SlMDC）基因的cDNA序列,其GenBank登录号为EU216564,测序结果表明该cDNA全长1269bp,编码422个氨基酸,与TC172759的核酸同源性为99%,氨基酸同源性为99%。氨基酸序列比对结果显示SlMDC与其他植物MDC的同源性较高。SlMDC系统进化树分析表明,SlMDC与其他物种的MDC具有共同的祖先。三维结构模型分析表明,SlMDC与酵母MDC相似的P环结构。通过半定量RT-PCR进行MDC组织表达分析表明SlMDC在整个植物表达水平较低,茎、花果实中表达量相对较高。原核表达的重组SlMDC蛋白的分子量大小与通过软件预测的分子量大小相同,都为46.7KD。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1.前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 植物萜类化合物生物合成途径及其关键酶研究进展
• 1.2.2 萜类代谢工程的研究策略
• 1.3 本研究的目的和内容
• 2.材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株、质粒及试剂
• 2.2.1 菌株及质粒
• 2.2.2 试剂
• 2.3 引物设计
• 2.4 常用培养基
• 2.4.1 LB液体培养基
• 2.4.2 LB固体培养基
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 番茄叶片总RNA的提取
• 2.5.2 RNA的反转录
• 2.5.3 基因cDNA的克隆
• 2.5.4 基因的生物信息学分析
• 2.5.5 原核表达载体的构建
• 2.5.6 基因cDNA在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.5.7 组织表达分析
• 2.5.8 SlIPI基因的功能验证
• 3.结果与分析
• 3.1 番茄叶片总RNA的提取及反转录
• 3.2 SlIPI基因cDNA的克隆与分析
• 3.2.1 SlIPI基因cDNA的克隆
• 3.2.2 SlIPI基因cDNA生物信息学分析
• 3.2.3 原核表达载体pETSlIPI的构建及诱导表达
• 3.2.4 SlIPI基因的功能验证
• 3.2.5 SlIPI基因组织表达分析
• 3.3 SlHMGS基因cDNA的克隆及分析
• 3.3.1 SlHMGS基因cDNA的克隆
• 3.3.2 SlHMGS基因cDNA生物信息学分析
• 3.3.3 原核表达载体pETSlHMGS的构建及诱导表达
• 3.4 SlMDC基因cDNA的克隆及分析
• 3.4.1 SlMDC基因cDNA的克隆
• 3.4.2 SlMDC基因cDNA生物信息学分析
• 3.4.3 原核表达载体pETSlMDC的构建及诱导表达
• 3.4.4 SlMDC基因组织表达分析
• 4.讨论
• 4.1 电子克隆在番茄基因克隆中的应用
• 4.2 生物信息学在基因功能研究中的应用
• 4.3 SlIPI和SlMDC基因表达的组织差异性
• 4.4 SlIPI、SlHMGS和SlMDC基因的功能验证
• 4.5 SlIPI、SlHMGS和SlMDC基因的应用前景
• 参考文献
• 致谢
• 附录:登记基因信息