提高单细胞分析选择性和芯片电泳进样性能的研究

论文摘要

芯片毛细管电泳（chip-based CE）是微全分析系统的一个重要研究领域,因具有分析速度快、样品和试剂消耗少、易于集成化等优点,其价值已被不同领域的科学家所认知和肯定。但在对成分复杂的单细胞内组分进行分析时,因芯片的通道长度有限,很难将细胞内所有感兴趣的物质都分离鉴定。进样方法决定了样品塞的质量和形状。样品塞的质量和形状又直接影响到分离效率。所以进样方法的选择对芯片毛细管电泳技术至关重要。近来,进样量可调的进样方法越来越受到关注。然而在目前一些体积可变的进样方法中,均需要四个或四个以上的电极结合复杂的供电电源,通过几次电动夹流进样才能实现。针对上述问题,我们使用芯片毛细管电泳技术结合选择性标记测定了单个HepG2细胞内的活性氧（ROS）的重要组分——超氧阴离子（O2-）。首次在芯片毛细管区带电泳中,用负压结合电动力实现了可变体积的进样方法。第一章综述了细胞内的标记方法及芯片毛细管电泳中的进样方法。第二章报道了用透膜荧光试剂（DHE）选择性标记后继用芯片毛细管电泳测定单细胞内的O2-的方法。近来文献报道,DHE的光化学氧化产物溴乙啶（E+）干扰荧光成像技术中单细胞内O2-的测定。本方法可以在20 s内很好地分离O2-标记后的荧光产物2—羟基溴乙啶和E+。检测下限达到了2.0 amol,比HPLC-EC技术低了三个数量级,比HPLC荧光检测技术低了五个数量级。并且,不同于HPLC的分析结果,在本方法中只检测到了2—羟基溴乙啶一种物质,说明用微流控芯片分析单细胞时,可以避免DHE光化学氧化成E+现象的发生。第三章研究了用一个廉价的负压装置结合一组高压电源实现了芯片毛细管区带电泳中进样量可调的进样方法。通过调节施加在样品废液池（SW）上的负压和缓冲液池（B）与缓冲液废液池（BW）两端的电压大小。样品池中的样品在负压作用下无歧视地输送到芯片十字交叉口后,样品在电场的作用下注入分离通道。进入分离通道样品带的长度和进样电压,进样时间成正比。撤去SW池上的负压,S,B池流向SW的液流也随着负压的撤消而消失,进入分离通道的样品塞在电场的作用下开始电泳分离。通过控制B池的液面高于S和SW池的液面,避免了分离过程中样品泄漏到分离通道中的现象。在本方法中,仅需控制进样时间就可以实现任意长度样品带的进样。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 细胞内的标记方法
• 1.2.1 柱前衍生
• 1.2.1.1 细胞作为微反应器进行的衍生反应
• 1.2.1.2 电穿孔技术
• 1.2.1.3 借助于脂质体和聚乙二醇（PEG）的衍生反应
• 1.2.2 柱上衍生
• 1.2.3 柱后衍生
• 1.2.4 量子点的标记
• 1.3 芯片毛细管电泳的进样技术
• 1.3.1 简单电动进样
• 1.3.2 电动夹流进样
• 1.3.3 动态进样
• 1.3.4 电动门式进样
• 1.4 小结
• 1.5 参考文献
• 第二章 芯片毛细管电泳测定单细胞内超氧阴离子的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器装置
• 2.2.2 试剂和材料
• 2.2.3 芯片的制作
• 2^-的标记'>2.2.4 细胞内O₂^-的标记
• 2.2.5 细胞溶膜液的制备
• 2.2.6 校正曲线的制作和细胞溶膜液的分析
• 2.2.7 单细胞的分析
• 2.3 结果与讨论
• 2^-与DHE反应时间的研究'>2.3.1 O₂^-与DHE反应时间的研究
• 2^-与DHE反应产物的研究'>2.3.2 O₂^-与DHE反应产物的研究
• 2.3.3 缓冲溶液的选择
• 2.3.4 标准曲线的制备
• 2.3.5 单细胞的分析
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 第三章 芯片区带电泳中实现可变体积进样的简单方法
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器装置
• 3.2.2 试剂和材料
• 3.2.3 玻璃芯片的制作
• 3.2.4 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 用原位合成多孔塞的方法实现可变进样体积
• 3.3.2 用调节负压的方法实现可变进样体积
• 3.3.3 电渗流对可变体积进样的影响
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 附录
• 致谢