九州虫草培养条件优化及其体外抗氧化抗癌活性研究

论文摘要

目的：为探索九州虫草液体培养条件下生物量与相关活性物质含量关系以及体外抗氧化与抗癌活性。对九州虫草菌丝的液体培养条件进行优化，并对其抗氧化活性，提取物的抗癌活性及其抗癌机制进行了初步探索，为寻找新型抗癌物质提供参考。方法：对九州虫草菌丝生长进行单因素试验，Box-Behnken响应面试验，得出最优生长条件；菌丝生物量测定采用烘干称重法，并用浓硫酸-苯酚和3,5-二硝基水杨酸法测量胞内多糖与胞外多糖的含量，利用高碘酸氧化法测量胞内甘露醇与胞外甘露醇的含量；利用抗氧化试剂盒对其菌丝水溶性的提取物以及发酵液制品进行抗氧化研究，测定总抗氧化能力、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等的活性；制备抗癌提取物样品，并对提取物进行初步分析；利用MTT比色法考察样品在时间以及剂量上对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞BGC823、人胃癌AGS和人宫颈癌细胞HeLa的体外增殖抑制情况及对人正常胚肺成纤维细胞HELF、胃正常上皮细胞GES1的毒性作用；应用普通倒置显微镜、AO染色荧光显微镜观察样品作用前后细胞形态学变化；流式细胞仪检测分析细胞周期分布。结果：九州虫草在加锌条件下经过Box-Behnken实验，结果获得菌丝生物量最优培条件为：葡萄糖6.04%，蛋白胨2.77%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.29%，硫酸锌200mg/L，装液量100ml/250ml，pH值6.0。优化后是原来无锌培养基菌丝干重的2.97倍。锌的添加可以显著的增加九州虫草胞内提取物的总抗氧化能力、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性。对乙酸乙酯以及三氯甲烷提取物初步分析，这两种物质中不仅含有甾醇类物质还含有其他待测成分。MTT法检测显示，不同的样品对于不同的细胞有不同的增殖抑制效果，对正常细胞的毒性作用相对较小。倒置显微镜、AO染色荧光显微镜观察乙酸乙酯提取物使癌细胞出现细胞体积缩小、染色质浓缩、细胞出泡、染色加深等细胞形态学改变；分析细胞周期发现对HepG2和AGS分别被阻滞于G1，S期。结论：对菌丝培养条件进行优化以求获得高产量的生物量对有效成分的提取是很重要的，九州虫草具有很好的抗氧化以及抗癌活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 引言
• 1.1 九州虫草培养概述
• 1.2 九州虫草化学成分及其药理活性
• 1.2.1 多糖类及其药理活性
• 1.2.2 黄酮类及其药理活性
• 1.2.3 核酸类及其药理活性
• 1.2.4 甘露醇类、甾醇类物质及其药理活性
• 1.2.5 虫草内其他物质
• 1.3 虫草提取物药理作用研究概况
• 1.3.1 提取物的抗癌作用
• 1.3.2 提取物的抗氧化作用
• 1.3.3 提取物的免疫激活作用
• 1.3.4 提取物的其他药理作用
• 1.4 细胞凋亡研究方法概述
• 1.4.1 MTT 法
• 1.4.2 细胞形态观察
• 1.4.3 流式细胞术
• 1.4.4 caspase 活性检测
• 1.4.5 其他研究方法
• 1.5 本论文研究背景意义、内容与创新点
• 1.5.1 研究背景意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 1.5.3 创新点
• 第二章 液体发酵条件对九州虫草生长的影响
• 2.1 主要仪器与试剂
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌丝体培养
• 2.2.2 胞内多糖含量测定
• 2.2.3 胞外多糖含量测定
• 2.2.4 胞内、胞外甘露醇含量测定
• 2.2.5 统计
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 单因素对菌丝干重的影响
• 2.3.2 单因素对多糖以及甘露醇含量的影响
• 2.3.3 Plackett-Burman 试验设计
• 2.3.4 最陡爬坡试验
• 2.3.5 Box-Behnken 试验设计
• 2.3.6 响应面分析及各组分最佳质量浓度的确定
• 2.3.7 验证实验
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 九州虫草抗氧化检测
• 3.1 主要仪器与试剂
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 抗氧化试验样品制备
• 3.2.2 抗氧化检测
• 3.2.3 统计学分析
• 3.3 结果
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 九州虫草抗癌样品制备及成分分析
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 主要仪器与材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 抗癌样品制备
• 4.2.2 检测分析
• 4.3 抗癌样品成分初步分析
• 4.3.1 无水乙醇光谱扫描
• 4.3.2 乙酸乙酯提取物光谱扫描
• 4.3.3 三氯甲烷提取物光谱扫描
• 4.3.4 甾醇类物质光谱扫描
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 九州虫草菌丝提取物的抗癌活性研究
• 5.1 实验材料与仪器
• 5.1.1 主要仪器和材料
• 5.1.2 药物与试剂
• 5.1.3 常用溶液的配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 细胞培养
• 5.2.2 MTT 法检测药物对癌细胞增殖抑制作用
• 5.2.3 统计学处理
• 5.3 结果
• 5.3.1 乙酸乙酯提取物对不同细胞的增殖抑制作用
• 5.3.2 三氯甲烷提取物对不同细胞的增殖抑制作用
• 5.3.3 甾醇类物质对不同细胞的增殖抑制作用
• 5.3.4 不同物质对不同细胞的 48 h 增殖抑制作用
• 5.3.5 三种物质对不同细胞增殖抑制 IC50 比较
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 九州虫草提取物抗癌机理初探
• 6.1 实验材料与仪器
• 6.1.1 药物与试剂
• 6.1.2 主要仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 细胞形态学观察
• 6.2.2 流式细胞术 PI 单染检测细胞周期相分布
• 6.2.3 Caspase 3 活性检测
• 6.2.4 Caspase 9 活性检测
• 6.2.5 统计学处理
• 6.3 结果与处理
• 6.3.1 细胞形态学观察
• 6.3.2 荧光显微镜观察
• 6.3.3 PI 单染检测周期相分布
• 6.3.4 caspase 3 与 caspase 9 检测
• 6.4 小结与讨论
• 结论
• 1.液体发酵条件对九州虫草生长的影响
• 2. 九州虫草抗氧化活性研究以及提取物的制备
• 3.抗癌样品制备以及成分初步分析
• 4.抗癌活性研究
• 5.抗癌作用机制研究
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历