Bacillus amyloliquefaciens高效合成2，3-丁二醇及其发酵调控

论文摘要

2,3-丁二醇是一种重要的生物基四碳平台化合物，被广泛应用于化工、食品、医药、燃料及航空航天等多个领域。随着石油资源日益短缺，微生物法合成2,3-丁二醇越来越受到人们的重视。目前，2,3-丁二醇高产菌株主要是克雷伯氏菌、产气肠杆菌和粘质沙雷氏菌，然而这些菌株都具有潜在致病性，不符合工业化安全生产的要求，虽然最近也有安全菌株（如枯草芽胞杆菌）的报道，但2,3-丁二醇产量偏低。本文通过传统育种的方法，筛选到一株具有工业化生产2,3-丁二醇潜力的安全菌株（解淀粉芽胞杆菌B10-127），并结合发酵调控与基因工程技术进行了以下研究工作：1.高产2,3-丁二醇安全菌株的筛选通过考察菌株在高浓度葡萄糖条件下生长及对葡萄糖利用效率与肌酸显色法相结合的方法，筛选到一株具有高产2,3-丁二醇潜力的菌株B10-127，通过细胞形态观察、生理生化特征鉴定和16Sr RNA序列分析，确定其为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。经初步发酵，2,3-丁二醇的产量为52.2g/L，生产强度为0.68g/（L h）。2.摇瓶水平发酵条件与培养基组分优化首先，在摇瓶水平上对解淀粉芽胞杆菌B10-127发酵葡萄糖合成2,3-丁二醇的培养条件进行优化，优化后的最适培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150r/min，培养基初始pH6.5，接种量6%。随后，经过单因素和响应面综合优化，确定最佳培养基组分为：玉米浆31.9，豆粕22.0，柠檬酸铵5.6，K2HPO43H2O2.5，MgSO47H2O0.3， MnSO47H2O0.05，FeSO47H2O0.05，琥珀酸0.3g/L。在优化后的最适条件下培养，菌体量提高了14.6%，发酵周期从76h缩短至48h，2,3-丁二醇产量达到63.4g/L，提高了21.4%，生产强度提高了91.3%，副产物乙偶姻降低了34.4%。3.玉米浆对2,3-丁二醇发酵调控机理初探考察了玉米浆对2,3-丁二醇发酵的影响，结果发现：在低玉米浆浓度下，菌体生长速率较低，此时副产物乙偶姻大量积累；在高的玉米浆浓度下，菌体快速生长，菌体量较高，且此时菌株主要积累2,3-丁二醇，而其前体物质（乙偶姻）积累量很少；与不添加玉米浆相比，2,3-丁二醇产率提高了55.6%，生产强度提高了1.52倍，乙偶姻积累量降低了69.0%，2,3-丁二醇/乙偶姻的比值提高了3.99倍。随后，我们初步探讨了玉米浆对2,3-丁二醇发酵的调控机理。乙偶姻还原酶专一催化乙偶姻合成2,3-丁二醇，同时需要NADH的参与。在高的玉米浆浓度下，发现菌体长势良好，菌体量高，提高了胞内NADH水平，并提高了糖耗效率，缩短了发酵周期；同时，在此情况下，乙偶姻还原酶活力较高，乙偶姻被迅速转化为2,3-丁二醇，并导致胞内NADH/NAD+比值下降。4.3-磷酸甘油醛脱氢酶与乙偶姻还原酶共表达研究在EMP途径中，3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）氧化3-磷酸甘油醛合成1,3-二磷酸甘油酸，需要等量的氧化型辅酶NAD+参与；在2,3-丁二醇支路中，乙偶姻还原酶（ACR）催化还原乙偶姻合成2,3-丁二醇，该步反应需要等量的还原型辅酶NADH参与，所以，在整个代谢途径中，GAPDH和ACR构成一个辅酶循环再生体系。我们首次尝试，将来源于解淀粉芽胞杆菌的依赖于NAD+的3-磷酸甘油醛脱氢酶和依赖于NADH的乙偶姻还原酶基因在解淀粉芽胞杆菌中过量表达，加强辅酶循环再生，成功的提高了发酵液中2,3-丁二醇的产量和生产强度。过量表达GAPD和ACR时，依赖于NADH的乙偶姻向2,3-丁二醇通量加强了16.7%，乙偶姻降低了60.9%，同样依赖于NADH的乳酸和琥珀酸支路的通量均呈现下降趋势，分别下降了25.9%和39.0%。5.发酵罐水平工艺参数的控制优化考察了溶氧对2,3-丁二醇合成的影响，结果发现：溶氧水平越高，菌体生长越快，发酵周期越短，但是2,3-丁二醇的产量越低，副产物乙偶姻的积累量越高。针对菌株在不同的发酵阶段对氧需求量的不同，我们采用分阶段控制转速的策略来调控发酵液中溶氧水平，具体方式如下：0-4h搅拌转速控制在较低水平350r/min，4-16h搅拌转速提高至400r/min，16h后搅拌转速降为350r/min。采用此三阶段搅拌转速调控策略进行2,3-丁二醇的分批发酵，结果发现：发酵28h，葡萄糖便消耗殆尽，此时葡萄糖消耗速度达到5.71g/（L h），2,3-丁二醇最高产量达到72.8g/L，生产强度2.60g/（L h）（比恒定转速为300、350和400r/min的分批发酵相比，分别提高了85.7%、41.3%和23.8%）；乙偶姻产量下降至4.72g/L（比恒定转速为300、350和400r/min的分批发酵相比，分别降低了53.3%、47.1%和69.2%）。2,3-丁二醇发酵过程前期，pH会因为有机酸的合成而逐步下降，菌株会转而合成中性物质2,3-丁二醇以阻止生长环境过度酸化，而后pH逐渐升高；而2,3-丁二醇合成的最适pH偏酸性，所以中后期应控制pH在6.5以下。随后，采用pH分段控制-脉冲补料发酵策略，2,3-丁二醇的最高产量达到133.2g/L，此结果可与前期报道的2,3-丁二醇高产菌相媲美。6.粗甘油与糖蜜共底物发酵生产2,3-丁二醇研究为了降低2,3-丁二醇的生产成本，提升目的菌株利用前景。我们尝试利用生物柴油副产物粗甘油为底物进行2,3-丁二醇发酵实验。研究发现，菌株利用糖质原料的效率明显高于利用甘油的效率，为了提高甘油利用率，我们尝试将蔗糖作为甘油发酵的辅底物，结果发现：蔗糖作为辅底物时，显著提高了菌株利用甘油合成2,3-丁二醇的效率。甜菜糖蜜是制糖工业中的一种副产品，含有大量的蔗糖，将甜菜糖蜜（替代蔗糖）作为辅底物与甘油共发酵，结果发现，菌体生长和底物消耗速率得到显著提高，进而提高了菌株利用甘油合成2,3-丁二醇的效率，同时降低了生产成本。采用分阶段供氧策略和分段控制pH-脉冲流加发酵，2,3-丁二醇最大产量达到83.3g/L，生产强度达到0.85g/（L h），此结果是目前报道的发酵粗甘油生产2,3-丁二醇的最高产量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 2,3-丁二醇的概述
• 1.1.1 2,3-丁二醇的性质
• 1.1.2 2,3-丁二醇的用途
• 1.2 2,3-丁二醇生产方法
• 1.3 微生物法合成 2,3-丁二醇的代谢途径
• 1.4 微生物合成 2,3-丁二醇的生理功能
• 1.5 2,3-丁二醇生产菌株
• 1.6 提高微生物合成 2,3-丁二醇效率的主要策略
• 1.6.1 菌种改良
• 1.6.2 培养基组分优化
• 1.6.3 发酵环境条件优化
• 1.7 本课题研究的意义与内容
• 1.7.1 本课题研究意义
• 1.7.2 本课题研究内容
• 第二章 2,3-丁二醇安全高产菌株的分离、筛选及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 土样
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要实验仪器
• 2.2.4 主要溶液及配制方法
• 2.2.5 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细菌的分离筛选
• 2.3.2 菌落及细胞形态观察
• 2.3.3 菌株的生理生化特征
• 2.3.4 16S rRNA 序列测定
• 2.3.5 基于 16S rRNA 序列分析的同源性与进化距离分析
• 2.3.6 分析方法
• 2.4 结果
• 2.4.1 菌株的分离与初筛
• 2.4.2 菌株复筛
• 2.4.3 菌株 B10-127 的菌体形态
• 2.4.4 菌株 B10-127 的生理生化特征
• 2.4.5 菌株 B10-127 的 16S rRNA 序列测定
• 2.4.6 B. amyloliquefaciens B10-127 生长曲线测定
• 2.4.7 B. amyloliquefaciens B10-127 发酵葡萄糖合成 2,3-丁二醇过程曲线
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 B.amyloliquefaciens生产 2,3-丁二醇摇瓶发酵条件研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养方法
• 3.2.4 分析方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 温度对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.2 摇床转速对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.3 初始 pH 对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.4 接种量对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.5 菌株 B10-127 对各类碳源利用情况
• 3.3.6 初始葡萄糖浓度对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.7 有机氮源对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.8 玉米浆对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.9 玉米浆和豆粕添加比例对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.10 无机氮源对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.11 K2HPO4 对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.12 有机酸对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.13 无机盐对菌株 B10-127 发酵生产 2,3-丁二醇的影响
• 3.3.14 Plackett-Burman Design 设计
• 3.3.15 最陡爬坡实验
• 3.3.16 Response Surface Methodology 分析实验
• 3.3.17 优化前后 2,3-丁二醇发酵过程曲线
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 玉米浆对 2,3-丁二醇发酵调控的机理初探
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种与质粒
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 培养方法
• 4.2.4 基因组 DNA 提取
• 4.2.5 PCR 产物克隆
• 4.2.6 细胞粗提取液的制备及 ACR 酶活测定方法
• 4.2.7 细胞内 NADH/NAD+ 提取及测定方法
• 4.2.8 分析方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 玉米浆添加量对菌株 B10-127 生长的影响
• 4.3.2 玉米浆添加量对菌株 B10-127 利用葡萄糖消耗速率的影响
• 4.3.3 玉米浆添加量对 2,3-丁二醇发酵的影响
• 4.3.4 玉米浆添加量对胞内乙偶姻还原酶酶活的影响
• 4.3.5 玉米浆添加量对胞内 NADH 和 NAD+ 浓度的影响
• 4.3.6 acr 基因敲除菌株的构建及酶活测定
• 4.3.7 玉米浆浓度对突变菌株 acr ::cat 发酵合成乙偶姻的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 通过加强辅酶循环再生促进 2,3-丁二醇合成
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种与质粒
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 培养方法
• 5.2.4 解淀粉芽胞杆菌基因组 DNA 提取
• 5.2.5 PCR 产物克隆
• 5.2.6 枯草芽胞杆菌转化方法
• 5.2.7 重组质粒稳定性分析
• 5.2.8 细胞粗提取液的制备及酶活测定方法
• 5.2.9 分析方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 gapA 和 acr 表达体系的构建和鉴定
• 5.3.2 gapA 和 acr 基因在解淀粉芽胞杆菌中的表达分析
• 5.3.3 过量表达 gapA 基因对解淀粉芽胞杆菌生长及 2,3-丁二醇发酵的影响
• 5.3.4 过量表达 acr 基因对解淀粉芽胞杆菌生长及 2,3-丁二醇发酵的影响
• 5.3.5 过量共表达 gapA 和 acr 基因对解淀粉芽胞杆菌生长及 2,3-丁二醇发酵的影响
• 5.3.6 重组菌 AG 代谢分析
• 5.3.7 玉米浆浓度对重组菌株 AG 生长和 2,3-丁二醇发酵的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 发酵罐水平 2,3-丁二醇发酵工艺控制研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌种
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 培养方法
• 6.2.4 分析方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 pH 对 2,3-丁二醇发酵的影响
• 6.3.2 不同溶氧水平菌株发酵生产 2,3-丁二醇的过程曲线
• 6.3.3 不同溶氧水平下菌株发酵生产 2,3-丁二醇的动力学特征
• 6.3.4 多阶段供氧控制模式的提出和实验验证
• 6.3.5 分批补料发酵
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 第七章 廉价底物粗甘油与糖蜜共底物发酵高效生产 2,3-丁二醇
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 菌株
• 7.2.2 培养基
• 7.2.3 培养方法
• 7.2.4 分析方法
• 7.3 结果
• 7.3.1 解淀粉芽胞杆菌对生物柴油副产物粗甘油的利用情况
• 7.3.2 糖作为辅底物对解淀粉芽胞杆菌利用甘油合成 2,3-丁二醇的影响
• 7.3.3 利用糖蜜作为辅底物提高菌株利用甘油合成 2,3-丁二醇的效率
• 7.3.4 糖蜜与粗甘油共底物发酵合成 2,3-丁二醇供氧工艺研究
• 7.3.5 糖蜜与粗甘油共底物流加发酵合成 2,3-丁二醇
• 7.4 讨论
• 7.5 本章小结
• 主要结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ：作者在攻读博士学位期间发表的论文及申请的专利
• 附录Ⅱ：菌株 B10-127的 16Sr RNA部分序列
• 附录Ⅲ：来源于解淀粉芽胞杆菌 B10-127的乙偶姻还原酶基因序列
• 附录Ⅳ：来源于解淀粉芽胞杆菌 B10-127的 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因序列