石竹杂种优势育种及农杆菌介导的遗传转化研究

论文摘要

石竹（Dianthus chinensis）（石竹科,石竹属）,一二年生草花,广泛应用于园林绿化及花卉装饰之中。本研究从石竹杂种优势育种、再生体系建立及遗传转化三个方面对石竹新品种培育、品种改良等方面进行了研究,主要内容及结果如下：1.石竹属植物杂种优势育种。对课题组现有22个自交系进行进一步自交纯化,其中18个自交系已自交8代以上；利用系谱法选育新的石竹及须苞石竹自交系,得到8个性状不同的石竹自交系和4个须苞石竹优良自交系。选用7个纯合自交系亲本（Z号、5号、H号、1号、LHD号、31号、41号）,按照GriffingⅡ进行石竹种内杂交,获得7个自交组合和21个杂交组合,分别对各组合单果结实数、发芽率进行比较,对21个杂交组合的观赏性状的杂种优势和遗传规律进行了研究。主要结果如下：（1）平均单果结实数最高的是自交系1b,每果72粒,结实数最低的是自交系5号,仅36粒,21个杂交组合的单果结实数处于两者之间；杂交组合的发芽率与亲本相比具有显著的杂种优势；（2）杂交组合观赏性状的杂种优势及遗传力分析：杂交组合在主要观赏性状上都具有明显的杂种优势,其中,开花密度、开花数、花头数、株高、株幅、花径,这些性状具有超亲优势；单朵花花期具有中亲优势；开花时间具有负向超亲优势；（3）优势杂交组合选育：通过对杂交组合各观赏性状的综合评价,筛选出10个优良F1代,分别是：H×31、H×41、H×LHD、LHD×31、LHD×41、5×31×5×H、Z×31、Z×H、31×41。2.石竹叶片愈伤组织诱导、再生及遗传转化研究。以课题组自交系1号叶片为材料进行叶片愈伤组织诱导及再生研究,结果表明：以叶片作为外植体进行愈伤组织诱导时,将叶片进行划伤处理,置于MS+2,4-D 1.Omg/L+NAA 0.3mg/L的培养基上诱导效率最高,为90-95%；MS+1.0 mg/LNAA+1.0 mg/LBA的培养基增殖效率最高,达到92%；在对愈伤组织进行状态调整时,1.0mg/L的2,4-D对愈伤组织的色泽和颗粒性有显著性影响,光照条件下,蔗糖浓度为60g/L时愈伤组织培养效果最好,愈伤组织色泽亮黄,颗粒性显著,无水渍化现象；愈伤组织在MS+BA 2.0mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1.0g/L的分化培养基中的分化率最高,为57.3%,再生芽长势健壮。将愈伤组织进行遗传转化研究,结果表明：石竹愈伤组织对Km的抗性筛选临界浓度为50mg/L,进行抑菌培养时宜设立Cef浓度为400 mg/L；预培养对瞬时表达率影响不显著,在进行愈伤组织遗传转化时可不进行预培养；侵染时间为10min瞬时表达率达80-85%,愈伤组织状态正常,颗粒性佳,分化能力强；共培养1d、2d的愈伤没有变蓝；共培养3d、4d、5d后均能不同程度的染上色,但4d后染上色的愈伤数量最多,5d后的愈伤状态变差,初步认为最佳共培养时间为4d。愈伤组织遗传转化体系为：预培养0d,侵染时间10-13min,黑暗条件下共培养4天；抗性愈伤进行再生培养后,提取再生植株基因组DNA进行PCR检测,阳性率36.4%。3.石竹叶片再生及遗传转化研究。以3个石竹自交系叶片为材料进行再生体系及转基因的研究。结果表明：叶片沿基部从茎段上撕下的再生率（65.2%）高于沿基部切下（再生率为0%）；20号和31号材料叶片以近轴面贴在培养基上的进行培养的再生效果更佳（再生率分别为40.1%和53.3%）；材料20和40的最优分化培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L,再生率分别达56.9%、93.2%；材料31号的分化培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L,再生率为66.6%。将再生植株进行生根培养,结果表明：20号和31号材料在基本的MS培养基中即可生根,生根率均为100%；40号在MS+0.1 mg/L IBA的培养基中,生根率达100%,平均根数5.17,平均根长3.69cm。无菌苗生根后经炼苗移栽至泥炭土+珍珠岩中的成活率（75.3%）明显高于另外两种移栽基质。用根癌农杆菌介导的方法对3个材料进行遗传转化体系的建立及目的基因的导入。结果表明：石竹叶片对潮霉素较敏感,20号、31号和40号的筛选压力分别为4mg/l、5mg/l、5mg/l。采用GUS瞬时染色方法,得出最适转化体系为：将叶片在分化培养基MS+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L上预培养2天；侵染10min；转移至共培培养基MS+BA1.0mg/L+N AA0.3mg/L+AS100mg/L中,共培养4天；再转移到选择培养基MS+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+Hyg4-5mg/L+Cef 400mg/L中进行生根筛选培养。经Hyg筛选及PCR检测,抗性芽分化率20号、31号和40号分别为4.44%、20.2%和23.5%。抗性植株下地后,对20号和40号株系进行瓶插寿命和盆栽花期评价,结果表明：转化20号反义ACO基因的4个株系中,瓶插寿命均比对照延长5d左右；转化40号正义ACO基因的12个株系中,5个株系的瓶插寿命延长3-4d。20号反义ACO基因的4个株系盆栽单朵花花期延长3-5d；群体花期延长14-20d。40号正义ACO基因的12个株系中,5个株系的盆栽单花花期延长4-6d；群体花期延长9-15d。

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摘要

Abstract

缩略词表

第一部分文献综述

1 石竹属植物简介

2 石竹育种目标

3 石竹属植物育种进展

3.1 有性杂交育种技术

3.1.1 有性杂交育种

3.1.2 杂交优势育种

3.1.3 石竹属植物杂交育种的研究

3.2 植物组织培养育种技术

3.2.1 植物组织培养在植物育种上的应用

3.2.2 石竹属植物组织培养的研究

3.3 植物基因工程育种

3.3.1 植物基因工程在植物育种上的应用

3.3.2 石竹属植物遗传转化体系的研究

3.3.3 石竹属植物鲜切花保鲜的研究

3.3.4 石竹属植物抗性育种的研究

3.3.5 其他方面研究进展

4 展望

5 本研究的内容、目的和意义

第二部分石竹杂种优势育种研究

前言

第一章优良自交系选育

1 试验材料

1.1 自交系材料

1.2 选育材料

1.3 试验药品及器材

2 试验方法

2.1 栽培和管理

2.2 自花辅助授粉和种子采收

2.3 测量项目及指标

2.4 数据统计和分析

3 结果与分析

4 讨论

第二章杂种优势育种及优良F1代选育

1 材料

1.1 试验材料

1.2 实验药品及器材

2 实验方法

2.1 按照Griffing完全双列杂交法Ⅱ进行杂交组合配制

2.2 测量指标及标准

2.3 数据统计与分析

2.3.1 组合间单果结实数、发芽率及移栽成苗率的比较

2.3.2 杂种优势分析

2.3.3 配合力分析

2.4 杂交组合F1代观赏性状比较及遗传规律分析

3 结果与分析

3.1 杂种优势分析

3.1.1 组合间单果结实数比较

3.1.2 组合间发芽率比较

3.1.3 杂交组合观赏性状测定及杂种优势分析

3.3 石竹主要观赏性状遗传规律分析

3.3.1 配合力方差分析

3.3.4 配合力效应分析

3.4 遗传力的估算

3.5 质量性状遗传分析

4 讨论

4.1 杂种优势分析

4.1.1 平均单果结实数

4.1.2 种子发芽率

4.1.3 观赏性状杂种优势分析

4.2 遗传规律分析

4.2.1 配合力分析

4.2.2 遗传力分析

4.2.3 花色及瓣性遗传

4.3 优良杂交组合筛选

第三部分石竹遗传转化研究

前言

第一章愈伤遗传转化体系的建立及抗性植株检测

1. 材料

1.1 试验材料

1.2 根癌农杆菌菌株及质粒

2 方法

2.1 叶片愈伤组织诱导及植株再生

2.1.1 叶片愈伤组织诱导

2.1.2 激素对愈伤组织增殖的影响

2.1.3 愈伤组织状态调整

2.1.4 激素对愈伤组织植株再生的影响

2.2 愈伤组织遗传转化体系的建立

2.2.1 抗生素敏感性筛选

2.2.2 不同因素对瞬时表达率的影响

2.3 GUS组织化学染色及再生植株PCR检测

2.4 数据统计与分析

3 结果与分析

3.1 叶片愈伤组织的诱导及植株再生

3.1.1 叶片愈伤组织的诱导

3.1.2 叶片愈伤组织的增殖

3.1.3 叶片愈伤组织的状态调整

3.1.4 叶片愈伤组织的植株再生

3.2 愈伤组织各遗传转化条件的确定

3.2.1 抗生素的敏感性筛选

3.2.2 预培养时间对瞬时表达率的影响

3.2.3 侵染时间对瞬时表达率的影响

3.2.4 共培养时间对瞬时表达率的影响

3.3 抗性愈伤组织植株再生及转基因植株PCR检测

4. 讨论

4.1 叶片愈伤组织的诱导

4.2 叶片愈伤组织的增殖

4.3 叶片愈伤组织的状态调整

4.4 叶片愈伤组织的植株再生

4.5 一种新型的石竹遗传转化受体材料

4.6 愈伤组织遗传转化因素探讨

第二章石竹叶片遗传转化研究

1 材料

1.1 试验材料

1.2 菌株与质粒

2 方法

2.1 叶片再生体系的建立

2.1.1 叶片再生

2.1.2 生根诱导

2.1.3 试管苗移栽

2.2 抗生素敏感性筛选

2.2.1 Km霉素的敏感性筛

2.2.2 Hyg霉素的敏感性筛

2.2.3 Cef霉素的敏感性筛

2.3 影响遗传转化因子的确立

2.3.1 预培养对石竹叶片再生的影响

2.3.2 AS对抗性芽分化的影响

2.3.3 侵染时间对抗性芽分化的影响

2.3.4 共培养时间对石竹叶片再生的影响

2.3.5 GUS组织化学染色

2.4 根癌农杆菌介导的ACC氧化酶（ACO）基因的导入

2.5 转化植株的鉴定

2.5.1 潮霉素抗性鉴定

2.5.2 PCR扩增

2.6 转基因植株的生理分析

2.6.1 转基因植株的瓶插寿命比较

2.6.2 转基因植株盆栽花期比较

2.7 数据统计与分析

3 结果与分析

3.1 影响叶片再生因素分析

3.2 根的诱导

3.3 炼苗移栽基质的选择

3.4 抗生素敏感性筛选

3.4.1 Km霉素的敏感性筛结果

3.4.2 Hyg霉素的敏感性筛结果

3.4.3 Cef霉素抑菌效果浓度筛选结果

3.5 农杆菌介导的叶片遗传转化体系的建立

3.5.1 预培养时间对转化效率影响

3.5.2 侵染时间对转化效率的影响

3.5.3 共培养时间对转化效率的影响

3.5.4 AS添加浓度对转化效率的影响

3.5.5 GUS瞬间表达、稳定表达检测

3.6 ACO基因抗性苗分化及转基因植株的检测

3.7 转基因植株的生理分析结果

3.7.1 转基因植株瓶插寿命比较

3.7.2 转基因植株盆栽花期比较

4. 讨论

4.1 叶片再生影响因素

4.2 转化受体的选择

4.3 转化效率相关因素

4.4 转基因植株花期延长比较

参考文献

致谢

图版

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