汉麻籽蛋白抗氧化肽的制备及其活性研究

论文摘要

随着人们生活水平的提高及对食品和营养摄入的要求越来越高,来源于天然、在食品和医药领域具有潜在应用前景的抗氧化多肽越来越受到人们的关注。汉麻籽蛋白作为一种新型蛋白资源,具有很高的开发研究价值。本论文主要研究了汉麻籽蛋白抗氧化肽的酶解工艺、体外抗氧化活性和分离纯化,并对H2O2损伤大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞（PC12）的保护作用进行了研究。论文首先研究了汉麻籽蛋白抗氧化肽的酶解工艺。通过单因素试验,响应面回归分析得到酶解的最佳工艺为:采用Alcalase2.4L碱性蛋白酶为酶源,汉麻籽蛋白50 mg/mL、水解时间2 h、温度50℃、加酶量2.2%（w/w）、pH 9.4。最优酶解条件下,水解度约为19%,10 mg/mL酶解产物的DPPH自由基清除率为82.65%,显示出较好的抗氧化活性。由于酶解过程中引入了大量盐离子,采用DA201-C大孔吸附树脂对汉麻籽蛋白酶解产物（HPHs）进行动态脱盐,脱盐率为93.03%,最大回收率为98.45%。脱盐后的HPHs亮度提升,色泽偏向乳白;疏水性氨基酸含量从脱盐纯化前的26.3 g/100g增加至纯化后34.47 g/100g;相对分子质量主要分布在3102600。采用4种常用的体外抗氧化模型来评价HPHs的抗氧化活性,脱盐后HPHs的还原力和清除自由基的能力比脱盐前有不同程度的增强。清除DPPH自由基、超氧阴离子以及羟基自由基的IC50分别从脱盐前的3.75 mg/mL、3.50 mg/mL、8.25 mg/mL降为脱盐后的2.75 mg/mL、3.00 mg/mL、7.70 mg/mL。本论文分别采用凝胶过滤色谱、半制备RP-HPLC和分析型RP-HPLC对脱盐后HPHs进行分离纯化,最后得到两个峰G-25-1-F-a和G-25-1-F-b。在0.02 mg/mL浓度下,其DPPH自由基清除率分别为71.24%和65.94%。经MALDI-TOF-TOF分析得G-25-1-F-a中母离子m/z 441.02和m/z 924.49氨基酸序列分别为NHAV和HVRETALV;G-25-1-F-b中母离子m/z 1199.54氨基酸序列可能为LECNKVDTMF或LKRDEAFCAF。在细胞水平上研究了G-25-1-F对氧化损伤细胞的保护作用。经0.15 mmol/L H2O2作用2 h后细胞活力减少到49.63%,建立了H2O2诱导的PC12氧化损伤模型。浓度为10μg/mL的G-25-1-F即对细胞有明显的保护作用,但是对损伤后细胞的修复作用不明显。G-25-1-F对神经细胞的保护作用机制可能是因为G-25-1-F通过提供氢与自由基结合,从而实现直接清除自由基或阻断自由基传递的通路,降低细胞损伤程度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 汉麻概况
• 1.2 世界汉麻生产的历史与现状
• 1.2.1 汉麻在国外的发展
• 1.2.2 汉麻在中国的发展
• 1.3 汉麻籽的研究状况
• 1.3.1 汉麻籽油
• 1.3.2 汉麻籽蛋白
• 1.4 活性肽的研究
• 1.4.1 活性肽的开发
• 1.4.2 抗氧化肽的研究进展
• 1.4.3 天然抗氧化肽的作用机理
• 1.4.4 肽的分离纯化
• 1.5 立题背景和意义
• 1.6 主要研究内容
• 第二章 汉麻籽蛋白的酶解工艺
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料和设备
• 2.2.1 实验原料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器及设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 汉麻籽冷榨粕分离蛋白的制备
• 2.3.2 汉麻籽蛋白的酶解工艺
• 2.3.3 酶解条件的响应面分析
• 2.3.4 基本成分的测定
• 2.3.5 蛋白酶活力测定
• 2.3.6 水解度的测定
• 2.3.7 抗氧化活性的测定
• 2.3.8 氨基酸组成的测定
• 2.3.9 蛋白质或多肽的疏水值的测定
• 2.3.10 数据统计与分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 汉麻籽分离蛋白的制备
• 2.4.2 不同蛋白酶对汉麻籽蛋白酶解效果的比较
• 2.4.3 酶解汉麻籽蛋白的工艺条件
• 2.4.4 酶解工艺条件的响应面优化
• 2.5 本章小结
• 第三章 汉麻籽蛋白酶解产物的精制及其体外抗氧化活性的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 大孔吸附树脂的脱盐工艺
• 3.3.2 基本成分分析方法
• 3.3.3 还原力的测定
• 3.3.4 DPPH 自由基清除率的测定
• 3.3.5 超氧阴离子自由基清除率的测定
• 3.3.6 羟基自由基清除率的测定
• 3.3.7 色泽的测定
• 3.3.8 氨基酸组成的测定
• 3.3.9 相对分子质量分布的测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 大孔吸附树脂的选择
• 3.4.2 酶解产物的动态脱盐
• 3.4.3 脱盐对酶解产物成分的影响
• 3.4.4 脱盐对酶解产物色泽的影响
• 3.4.5 脱盐对酶解产物氨基酸组成的影响
• 3.4.6 脱盐后酶解产物的相对分子量分布
• 3.4.7 脱盐前后酶解产物清除自由基的效果
• 3.5 本章小结
• 第四章 汉麻籽蛋白抗氧化活性肽的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 凝胶过滤色谱对酶解产物的分离纯化
• 4.3.2 半制备RP-HPLC（反相高压液相色谱）分离纯化
• 4.3.3 分析型RP-HPLC 分离纯化
• 4.3.4 DPPH 自由基清除率的测定
• 4.3.5 MALDI-TOF-TOF 质谱测定氨基酸序列
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 Sephadex G-25 分离纯化脱盐后酶解产物
• 4.4.2 G-25 各洗脱峰对DPPH 自由基清除能力的比较
• 4.4.3 半制备RP-HPLC 对G-25-1 的分离纯化
• 4.4.4 分析型RP-HPLC 对G-25-1-F 的分离纯化
• 4.4.5 特征短肽的氨基酸序列分析
• 4.5 本章小结
• 2O₂损伤PC12 细胞的保护作用'>第五章 汉麻籽抗氧化活性肽对H₂O₂损伤PC12 细胞的保护作用
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料与仪器
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 试剂配制
• 5.3.2 细胞株及其培养
• 2O₂ 对PC12 细胞氧化损伤模型的建立'>5.3.3 H₂O₂ 对PC12 细胞氧化损伤模型的建立
• 5.3.4 MTT 法检测细胞存活率
• 5.3.5 G-25-1-F 对PC12 细胞的保护和修护作用的研究
• 5.3.6 细胞形态观察
• 5.3.7 数据统计及分析
• 5.4 结果与讨论
• 2O₂ 对PC12 细胞损伤模型的建立'>5.4.1 H₂O₂ 对PC12 细胞损伤模型的建立
• 2O₂ 损伤PC12 细胞活力的保护作用'>5.4.2 G-25-1-F 对H₂O₂ 损伤PC12 细胞活力的保护作用
• 2O₂ 损伤PC12 细胞活力的修复作用'>5.4.3 G-25-1-F 对H₂O₂ 损伤PC12 细胞活力的修复作用
• 5.4.4 细胞形态学分析
• 5.5 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文