红豆杉中与异戊二烯代谢途径相关的AP2类转录调控因子的克隆与功能研究

论文摘要

异戊二烯代谢途径（Isoprenoid Biosynthetic Pathway）是植物萜类次生代谢物合成的重要途径,该途径中生成的异戊二烯类代谢产物包括青蒿素、紫杉醇、银杏内酯和其他萜类吲哚生物碱等都具有重要的经济价值。其中,红豆杉（Taxuscuspidata）异戊二烯代谢途径产物之一的紫杉醇(Taxol?)因其独特的抗癌机理和广谱性,在临床上被广泛应用,但受红豆杉生长缓慢、紫杉醇含量低和合成成本高等因素的制约,其产量一直难于提高,使得运用基因工程手段来提高紫杉醇生物合成的研究成为近年来次生代谢工程中的研究热点之一。转录因子（Transcription Factor,TF）作为后基因组中改造植物代谢途径的一种新型工具,具有从宏观调控次生代谢通量的优势。目前与次生代谢途径相关的转录因子研究多集中在苯丙氨酸代谢途径和生物碱代谢途径上,已报道的与萜类合成转录水平调控相关的转录因子只有TIA合成途径中的ORCA1-3家族和ZCT1-3家族,而对于红豆杉中异戊二烯代谢途径相关转录因子的研究还处于空白。本文首次利用酵母单杂交（Yeast One-Hybrid）方法和cDNA末端快速扩增技术（Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE）从东北红豆杉cDNA文库中克隆到两个AP2类转录因子基因,TcAP2和TcDREB,并对它们与红豆杉异戊二烯代谢途径紫杉醇合成途径中的多个关键酶基因的启动子的结合情况进行了研究,为深入研究AP2类转录因子能否参与对紫杉醇合成的转录调控奠定了基础。以JERE作诱饵,利用酵母单杂交的建库和筛选方法首次从东北红豆杉中克隆到与MeJA诱导相关的AP2类转录因子基因TcAP2,其开放阅读框（OpenReading Frame,ORF）编码长度为268个氨基酸的蛋白,分子量29.6kD,等电点5.05,拓扑结构显示该转录因子具有典型的AP2结构域特征:3个反向平行的β-折叠和1个α-螺旋。其DNA结合域内有DREB亚族特有的Val14和Ala37氨基酸残基,分别是DREB亚族转录因子与DRE元件和GCC Box元件的结合位点。进化树分析及同源比对分析都表明,该蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的At1g21910基因所编码的AtAP2和小立碗藓（Physcomitrella patens）中的PpAP2转录因子进化关系最近,属于同一分支,其DNA结合域的一致性达到85%以上。通过Southern blot分析表明该基因在东北红豆杉中以单拷贝形式存在。通过RACE方法从东北红豆杉中克隆到第二个AP2类转录因子基因TcDREB,其ORF编码410个氨基酸的蛋白,也具有典型的AP2结构域,空间构象及结合的顺式元件类型与TcAP2类似。进化树分析和多重比对表明,就DNA结合域而言,该转录因子与长春花（Catharanthus roseus）的ORCA1和大豆（Glycinemax）的GmDREBa的一致性最高。Southern blot表明该基因在东北红豆杉中也以单拷贝形式存在。亚细胞定位结果表明两个转录因子都定位在细胞核中。半定量RT-PCR分析显示,它们在幼茎中的表达量最高。RT-QPCR（Real-time Quantitative PCR）表明TcAP2转录水平的表达主要受MeJA和SA、高盐和低温的诱导;而TcDREB的表达受高盐、MeJA和SA以及ABA的诱导。凝胶电泳迁移率实验（Electrophoretic Mobility Shift Assays,EMSA）显示,两个转录因子都能与DRE顺式元件结合。其中TcDREB还能与紫杉醇合成途径中的TS、5α、10β和13α四个关键酶基因的启动子以及TS基因启动子上的GCC Box结合,而突变后的GCCBox不结合TcDREB。进一步用原子力显微镜（Amotic Force Microscope,AFM）证实其结合的特异性,发现加入游离的TcDREB蛋白能使其与DRE元件的结合概率从（19.3±5.2）%下降到（3.9±1.3）,而与MDRE的结合概率仅为（4.5±1.6）%,结合成键分布概率验证了TcDREB与DRE元件及四个启动子结合的特异性。综合分析认为,TcDREB与红豆杉异戊二烯代谢产物紫杉醇的合成途径相关,并且这种相关性可能是受ABA信号传导途径调控的。对于TcDREB结合启动子上的顺式元件的具体类型还有待进一步启动子缺失的结合实验证明。为了探明这两个转录因子在红豆杉中与异戊二烯代谢途径的产物紫杉醇的合成途径的相关性,进一步构建了TcAP2基因和TcDREB基因的植物表达载体并转化拟南芥;同时构建了TS、5α、10β和13α四个关键酶基因的启动子融合gus基因的植物表达载体与转录因子基因植物表达载体共转化拟南芥,已获得转TcDREB基因的阳性植株,为进一步研究其在紫杉醇代谢中的作用打下了基础。

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中文摘要

Abstract

引言

第一章文献综述

1 植物次生代谢途径转录因子的基本概念

1.1 次生代谢概念

1.2 植物次生代谢调节

1.3 植物次生代谢的转录因子的调控研究

2 植物次生代谢工程的研究策略

2.1 导入单个或多个靶基因

2.2 反义RNA和RNAi干涉

2.3 改变分叉代谢途径的流向

2.4 信号分子的引入

2.5 转录因子基因的表达调节

3 植物转录因子的研究

3.1 植物转录因子的结构与功能

3.2 植物次生代谢转录因子的分离与鉴定

4 植物的次生代谢途径中的转录因子研究

4.1 苯丙氨酸代谢途径中的转录因子

4.2 萜类合成代谢途径中的转录因子

5 转录因子功能研究的新方法—原子力显微镜（Amotic Force Microscope AFM）

第二章酵母单杂交（Yeast One-Hybrid）方法筛选东北红豆杉（Taxus cuspidata）中与甲基茉莉酸诱导相关的转录因子研究

前言

1 材料与方法

1.1 植物材料及诱导培养

1.2 菌株和载体

1.3 试剂

1.4 试剂和培养基

1.5 实验方法

2 结果与讨论

2.1 建库诱导时间的确定

2.2 东北红豆杉ds cDNA文库的构建和均一化处理

2.3 酵母单杂交系统的建立

2.4 酵母文库的筛选

2.5 筛选获得的putative转录因子片段

2.6 东北红豆杉AP2转录因子基因全长cDNA的获得及分析

2.7 TcAP2基因的分子进化分析

2.8 TcAP2的二维结构分析

2.9 TcAP2的DNA结合域结构分析

2.10 TcAP2三维结构及功能域的预测与分析

2.11 TcAP2基因的Southern blot分析

3 小结

第三章东北红豆杉中与异戊二烯代谢途径相关的TCDREB转录因子基因的克隆

1 材料与准备

1.1 植物材料及诱导

1.2 菌株和载体

1.3 酶与试剂盒

1.4 引物

2 方法

2.1 东北红豆杉总RNA的抽提及质量检测

2.2 东北红豆杉总DNA的抽提及质量检测

2.3 DNA片段的回收、连接、克隆和测序

2.4 TcDREB目的基因的克隆

2.5 TcDREB基因的Southern blotting分析

2.6 生物信息学分析

3 结果与讨论

3.1 TcDREB全长cDNA的获得及分析

3.2 TcDREB编码区推导的蛋白序列性质分析

3.3 TcDREB转录因子的叶绿体前导肽分析

3.4 TcDREB Homolog的序列比对和分析

3.5 TcDREB的分子进化分析

3.6 TcDREB的二维结构和拓扑学结构分析

3.7 TcDREB的功能域和三维结构预测分析

3.8 TcDREB基因的Southern blot分析

4 小结

第四章与红豆杉异戊二烯代谢途径相关的AP2转录因子的功能分析

1 材料

1.1 植物材料

1.2 菌株和载体

1.3 试剂

1.4 仪器和设备

2 方法

2.1 His-TcAP2和His-TcDREB融合蛋白的诱导表达、纯化和复性

2.2 TcAP2∷GFP和TcDREB∷GFP融合蛋白在洋葱细胞表皮的亚细胞定位

2.3 TcAP2基因和TcDREB基因的表达谱分析

2.4 TcAP2基因和TcDREB基因的逆境表达模式分析

2.5 凝胶滞后实验（EMSA）

2.6 原子力学显微法

2.7 转录因子单转及与顺式元件共转化拟南芥

3 结果和分析

3.1 TcAP2和TcDREB基因的原核表达及蛋白纯化

3.2 TcAP2∷GFP和TcDREB∷GFP融合蛋白的亚细胞定位

3.3 TcAP2基因和TcDREB基因组织表达的特异性

3.4 TcAP2基因和TcDREB基因与逆境相关诱导的表达分析

3.5 红豆杉紫杉醇合成途径中TS,5α,10β和13α启动子区的结构分析

3.6 TcAP2和TcDREB与顺式元件结合的凝胶滞后结果

3.7 TcAP2和TcDREB与紫杉醇合成途径中TS,5α,10β和13α启动子区的结合

3.8 AFM法测定TcDREB与DRE元件及紫杉醇合成途径中TS、5α、10β和13α启动子区结合的单分子作用力

3.9 TcAP2和TcDREB转录因子基因单转和共转化拟南芥

3.10 转基因拟南芥的筛选及PCR检测

4 小结

第五章总结与展望

1.研究总结

2.本文创新点

3.后续研究方向

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢

红豆杉中与异戊二烯代谢途径相关的AP2类转录调控因子的克隆与功能研究

论文摘要

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