论文题目: 银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 庞永珍
导师: 唐克轩,杨金水,沈大棱
关键词: 银杏,黄酮类化合物,萜类化合物,生物合成途径,查尔酮合成酶基因,黄烷酮羟化酶基因,黄酮醇合成酶基因,花色素还原酶基因,羟基甲基戊二酰还原酶基因,甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶,分子克隆,末端快速扩增,生物信息学,系统发生树,基因组步移,蛋白表达,遗传互补,功能验证,遗传转化,代谢工程
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 银杏是植物中的“活化石”,银杏叶提取物含有许多对人类健康有益的活性成分,其中最重要的是银杏黄酮和萜类化合物。然而,银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径在分子遗传学水平上还很少报道。为了深入研究银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径,并为今后利用基因工程技术提高银杏黄酮和萜类化合物含量打下基础,本文首次克隆并研究了参与银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中的六个重要酶的基因,它们分别是黄酮类生物合成途径中的查尔酮合成酶基因(GbCHS)、黄烷酮3-羟化酶基因(GbF3H)、黄酮醇合成酶基因(GbFLS)和花色素还原酶基因(GbANR),另外两个是萜类生物合成途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因(GbHMGR)和甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因(GbMVD)。 查尔酮合成酶催化黄酮类化合物生物合成途径的第一个关键步骤。本文采用RACE和PCR方法,获得了GbCHS基因的全长cDNA序列及其基因组序列,两者之间的序列比对结果表明,GbCHS基因含有两个外显子和一个内含子,这也是CHS基因的特征之一。推导的GbCHS蛋白和其它植物来源的CHS蛋白具有很高的相似性,GbCHS中存在与晶体结构和功能已知的苜蓿查尔酮合成酶完全相同的活性位点,如CoA结合位点、袋状桂皮酰结合位点和袋状环化位点等。使用同源性建模得到的GbCHS三维结构与苜蓿MsCHS2的三维结构高度相似。CHS系统发生树分析结果表明,GbCHS与裸子植物具有更近的进化关系。Southern blot分析表明,GbCHS基因属于一个多基因家族。RT-PCR分析表明,GbCHS基因在根、茎和叶中的表达水平不同,而且其表达受UV-B和伤处理的诱导。原核表达的重组GbCHS蛋白的分子量大小和通过生物信息学预测的分子量大小相同。Western blot分析表明,含有6×His标签的重组GbCHS蛋白可以和6×His的抗体产生特异的免疫反应。GbCHS已被构建到植物表达载体p1304
论文目录:
摘要
Abstract
引言
第一章 文献综述
1.1 黄酮类化合物生物合成的研究进展
1.1.1 黄酮类化合物的分布和分类
1.1.2 黄酮类化合物的作用
1.1.3 黄酮类化合物的生物合成
1.2 萜类化合物生物合成的研究进展
1.2.1 萜类化合物中心前体(IPP)的生物合成
1.2.3 萜类生物合成途径中的烯丙基转移酶和萜类环化酶
1.2.3 萜类生物合成途径中的修饰酶类
1.3 银杏黄酮和萜类化合物的研究进展
第二章 材料与方法
2.1 植物材料及其处理
2.2 菌株和载体
2.2.1 大肠杆菌菌株
2.2.2 农杆菌菌株
2.2.3 酵母菌株
2.2.4 载体
2.3.试剂
2.3.1 标准试剂
2.3.2 限制性内切酶
2.3.3 分子量标准
2.3.4 其它主要试剂的配制
2.4 试验方法
2.4.1 RACE cDNA文库的构建
2.4.2 银杏基因组步移文库的构建
2.4.3 DNA片段的回收、连接、克隆和测序
2.4.4 GbCHS基因的克隆和性质研究
2.4.5 GbF3H基因的克隆和性质研究
2.4.6 GbFLS基因的克隆和性质研究
2.4.7 GbANR基因的克隆和性质研究
2.4.8 GbHMGR基因的克隆和性质研究
2.4.9 GbMVD基因的克隆和性质研究
第三章 结果与讨论
3.1 银杏CHS基因的克隆和性质研究
3.1.1 GbCHS基因全长cDNA的克隆及其特征分析
3.1.2 GbCHS基因组序列的克隆及其特征分析
3.1.3 GbCHS蛋白的特征分析
3.1.4 GbCHS蛋白的三维模型分析
3.1.5 GbCHS基因的系统发生树分析
3.1.6 GbCHS基因的Southern blot分析
3.1.7 GbCHS基因的表达分析
3.1.8 原核表达载体pQE30-GbCHS的构建和表达分析
3.1.9 植物表达载体p1304-GbCHS的构建和植物转化
3.2 银杏F3H基因的克隆和性质研究
3.2.1 GbF3H基因全长cDNA和基因组DNA序列的克隆及其特征分析
3.2.2 GbF3H蛋白的特征分析
3.2.3 GbF3H蛋白的三维模型分析
3.2.4 GbF3H基因的系统发生树分析
3.2.5 GbF3H基因的Southern blot分析
3.2.6 GbF3H基因的表达分析
3.2.7 原核表达载体pQE30-GbF3H的构建和表达分析
3.3 银杏FLS基因的克隆和性质研究
3.3.1 GbFLS基因全长cDNA和基因组DNA序列的克隆及其特征分析
3.3.2 GbFLS蛋白的特征分析
3.3.3 GbFLS基因的5′侧翼序列分析
3.3.4 GbFLS蛋白的三维模型分析
3.3.5 GbFLS基因的系统发生树分析
3.3.6 GbFLS基因的Southern blot分析
3.3.7 GbFLS基因的表达分析
3.3.8 原核表达载体pQE30-GbFLS的构建和重组蛋白表达分析
3.3.9 植物表达载体p1304-GbFLS的构建和植物转化
3.4 银杏ANR基因的克隆和性质研究
3.4.1 GbANR基因全长cDNA和基因组DNA序列的克隆及其特征分析
3.4.2 GbANR蛋白的特征分析
3.4.3 GbANR基因的系统发生树分析
3.4.4 GbANR基因的Southern blot分析
3.4.5 GbANR基因的表达分析
3.4.6 原核表达载体pQE30-GbANR的构建
3.5 银杏HMGR基因的克隆和性质研究
3.5.1 GbHMGR基因全长cDNA和基因组DNA序列的克隆及其特征分析
3.5.2 GbHMGR蛋白的特征分析
3.5.3 GbHMGR蛋白的三维模型分析
3.5.4 GbHMGR基因的系统发生树分析
3.5.5 GbHMGR基因的Southern blot分析
3.5.6 GbHMGR基因的表达分析
3.5.7 酵母表达载体pYES2-GbHMGR的构建
3.6 银杏MVD基因的克隆和性质研究
3.6.1 GbMVD基因全长cDNA和基因组DNA序列的克隆及其特征分析
3.6.2 GbMVD蛋白的特征分析
3.6.3 GbMVD蛋白的三维模型分析
3.6.4 GbMVD基因的系统发生树分析
3.6.5 GbMVD基因的Southern blot分析
3.6.6 GbMVD基因的表达分析
3.6.7 GbMVD基因在酵母中的异源表达及功能验证
总结
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的SCI论文
致谢
论文独创性声明
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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