HSP65-PSA多表位融合蛋白疫苗的功能研究

论文摘要

分子量为65KD的卡介苗热休克蛋白（BCG HSP65）具有分子伴侣功能。在免疫应答过程中,HSP65与肿瘤表位抗原形成的融合蛋白,通过受体介导进入树突状细胞（dendritic cell, DC）,HSP65协助与之融合的抗原,进入MHC I类加工途径并递呈在细胞表面,从而激活抗原特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的免疫反应。本研究针对前列腺癌肿瘤相关抗原（PSA）的表位抗原,设计并制备了HSP65融合蛋白疫苗,拟将其研制成一种能诱导产生PSA特异性CTL的前列腺癌的预防性或治疗性疫苗。我们将编码分支杆菌热休克蛋白65基因与多个PSA表位基因进行融合,在大肠杆菌中表达多表位融合蛋白（HSP65-PSA）。首先我们构建了表达人PSA多表位基因的、来源于C57BL/6小鼠的B16、RM1和EL4三种肿瘤细胞系。应用此三株细胞在小鼠体内进行抑瘤的实验表明:HSP65-PSA能够诱生小鼠的PSA特异性CTL,对表达人PSA的小鼠肿瘤细胞的生长产生不同程度的抑制作用。体外功能实验表明:用HSP65-PSA装载人DC的HSP65-PSA诱导产生的CTL,能够杀伤装载HLA-A2限制性PSA表位肽的T2靶细胞。PSA表位肽装载树突状细胞（dendritic cell, DC）用于刺激自体naive T淋巴细胞产生的CTL,能够杀伤表达全长PSA蛋白的人前列腺癌细胞系LNCaP。为了研究HSP65-PSA的作用机理,我们制备了HSP65单克隆抗体和FITC标记的HSP65,并研究了人DC可能存在的HSP65受体。结果表明:人DC表面存在HSP65受体,此受体与CD91分子无相关性。以上工作表明,HSP65-PSA重组蛋白可能通过DC的HSP65受体发挥其抗肿瘤作用,它有希望成为有效的前列腺癌预防性和治疗性疫苗。

论文目录

• 英文缩写词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1. 前列腺癌的研究进展
• 1.1 前列腺癌的发生发展
• 1.2 前列腺癌肿瘤相关抗原（TAA）和前列腺特异性抗原（PSA）
• 1.3 PSA 的生物学功能
• 1.4 前列腺癌患者的免疫状态
• 1.5 免疫系统识别肿瘤细胞
• 1.6 前列腺癌的免疫治疗
• 1.7 表达人PSA 抗原表位的动物模型
• 2. 热休克蛋白在肿瘤免疫治疗中的应用
• 2.1 HSP 具有分子伴侣功能
• 2.2 HSP 具有载体功能
• 2.3 HSP 具有交叉提呈作用
• 2.4 HSP 具有活化抗原提呈细胞（APC）作用
• 2.5 HSP-肽复合物或HSP-融合蛋白对特异性CTL 的激活
• 2.6 HSP-多肽复合物或融合蛋白临床研究进展
• 2.7 HSP 的受体和信号传递
• 第二章 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 抗体
• 1.2 细胞因子
• 1.3 化学试剂
• 1.4 质粒、菌种和蛋白
• 1.5 试剂盒
• 1.6 细胞株和实验动物
• 1.7 层析用介质
• 1.8 培养基
• 1.9 缓冲液
• 1.10 PSA 与MUC1 表位肽
• 1.11 主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 稳定表达人PSA 或MUC1 蛋白的小鼠肿瘤细胞系的建立与鉴定
• 2.2 HSP65-PSA 和HSP65 融合蛋白的表达、纯化和鉴定
• 2.3 HSP65-PSA 蛋白疫苗的小鼠体内抑瘤实验
• 2.4 针对 HSP65 蛋白的单克隆抗体制备、鉴定与应用
• 2.5 树突状细胞表面HSP65 受体研究
• 2.6 HSP65-PSA 重组蛋白人体外功能实验
• 第三章 实验结果
• 1. 表达人PSA 或MUC1 蛋白的小鼠肿瘤细胞系的建立
• 1.1 质粒的纯化与鉴定
• 1.2 机械介导方法提高脂质体转染效率
• 1.3 改良法与传统法在转染和克隆筛选方面的比较
• 1.4 转染细胞的选择培养和克隆筛选
• 1.5 转染细胞的克隆筛选特性
• 1.6 激光共聚焦显微镜检侧
• 1.7 流式细胞术检测
• 1.8 转染细胞表达目的蛋白 PSA 的细胞免疫荧光鉴定结果
• 1.9 转染细胞表达目的蛋白 MUC1 的细胞免疫荧光鉴定结果
• 1.10 Western blot 检测结果
• 1.11 转染细胞稳定性的初步观察
• 1.12 转染细胞形态结构变化
• 1.13 转染细胞体内种植实验
• 2. HSP65-PSA 和 HSP65 重组蛋白的纯化与鉴定
• 2.1 蛋白定量
• 2.2 蛋白的纯度检测
• 2.3 LPS 检测
• 3. HSP65-PSA 重组蛋白的抑瘤效应
• 3.1 HSP65-PSA 对B16/PSA 肿瘤细胞生长的抑制作用
• 3.2 HSP65-PSA 对PSA-RM1 肿瘤细胞生长的抑制作用
• 4. HSP65 单克隆抗体的制备、鉴定与应用
• 4.1 鼠免疫血清中特异性抗体检测
• 4.2 细胞融合和阳性筛选结果
• 4.3 抗体效价检测
• 4.4 抗体特异性鉴定
• 4.5 杂交瘤细胞产生抗体的亚型分析
• 4.6 杂交瘤细胞核型分析结果
• 4.7 抗体的竞争抑制试验
• 4.8 HSP65McAb 在HSP65-MUC1 鉴定中的应用
• 4.9 HSP65 McAb 在HSP65 融合蛋白功能研究中的应用
• 5. DC 表面的HSP65 蛋白受体研究
• 5.1 FITC-HSP65 蛋白纯化
• 5.2 FITC-HSP65 蛋白的鉴定
• 5.3 DC 的诱导与分化结果
• 5.4 HSP65 与DCs 结合的流式细胞术检测结果
• 5.5 HSP65 特异性结合DC 表面受体
• 5.6 HSP65 在37℃条件下的内化结果
• 5.7 FITC-HSP65 结合DC 表面受体的饱和曲线
• 5.8 HSP65 重组蛋白对FITC-HSP65 竞争抑制作用结果
• 5.9 HSP65 McAb 对FITC-HSP65 结合 DCs 的竞争抑制
• 5.10 CD91 分子与HSP65 受体在DC 表面的分布相关性
• 5.11 HSP65 蛋白刺激DC 表达CD86 分子
• 5.12 LPS 与HSP65 和细胞成熟因子刺激DC 成熟能力的比较
• 5.13 影响 DC 表面受体表达的一些因素
• 6. 人体外功能实验
• 6.1 单核细胞表面 MHC-A2 分子的检测
• 6.2 显微镜检测HSP65-PSA 蛋白对DC 的刺激成熟作用
• 6.3 流式细胞术检测HSP65-PSA 对DC 的刺激成熟作用
• 6.4 装载 HSP65-PSA 的mDCs 刺激naiveT 细胞的增殖
• 6.5 装载 HSP65-PSA 的mDCc 刺激产生 CD8+T 淋巴细胞的比例
• 6.6 MHCⅠ类分子Dimer 染色法分析特异性CTL
• 6.7 ELISPOT 法原位检测IFNγ的分泌结果
• 6.8 T2 细胞表面表达HLA-A2 检测
• 6.9 T2 细胞表面HLA-A2 分子与PSA 表位肽的亲合力
• 6.10 人体外PSA 特异的 CTL 杀伤试验结果
• 第四章 讨论
• 1. PSA 治疗性疫苗的应用前景
• 2. 前列腺癌表位的选取及其在抗肿瘤免疫中的作用
• 3. HSP65-PSA 疫苗的设计
• 4. 改良的脂质体转染方法
• 5. 转染细胞的特性鉴定
• 6. 前列腺癌动物模型的制备
• 7. HSP65-PSA 融合蛋白在小鼠体内抑瘤效应分析
• 8. DC 表面存在HSP65 受体
• 9. HSP65-PSA 蛋白在人体外诱生出人 PSA 特异性的 CTL
• 10. HSP65 单克隆抗体制备与应用
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间已发表文章
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢
• 个人简历