高压匀浆耦合双水相体系对胞内L-天冬酰胺酶释放提纯的研究

论文摘要

L—天冬酰胺酶（EC 3.5.1.1）是治疗白血病的有效药物,普遍应用于临床。本文利用双水相系统耦合高压匀浆技术释放大肠杆菌细胞内L—天冬酰胺酶,将释放与纯化步骤相结合,并优化L—天冬酰胺酶释放率的操作条件。操作压力低于120 Mpa时,高压匀浆四次后,L—天冬酰胺酶活性丢失17.8%;添加三聚共嵌聚合物PEO-PPO-PEO可以提高L—天冬酰胺酶耐高压性;而加入KH2PO4和K2HPO4混合盐（KHP）加速酶的失活。与高压匀浆常规操作过程相比,在EOPO和KHP形成的双水相体系中,高压匀浆操作时L—天冬酰胺酶回收率大大提高。实验证明:高压匀浆破碎细胞率高,而双水相系统直接释放L—天冬酰胺酶不产生大量的细胞碎片,酶的释放率较高,结合两者优势,是一种有应用价值的释放胞内酶的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 引言
• 1.1 蛋白质分离纯化的现状及发展趋势
• 1.1.1 蛋白质分离纯化的原则
• 1.1.2 蛋白质纯化的现状
• 1.1.3 蛋白质过程优化
• 1.1.4 蛋白质分离纯化的发展趋势
• 1.2 双水相体系
• 1.2.1 双水相的种类及特点
• 1.2.2 双水相成相机理
• 1.2.3 双水相相图
• 1.2.4 双水相分配萃取原理及其影响因素
• 1.2.5 双水相体系萃取的特点
• 1.2.6 双水相萃取分离技术研究现状及发展趋势
• 1.2.7 双水相萃取技术的局限
• 1.2.8 双水相体系展望（双水相萃取技术与其他分离过程集成藕合强化分离效率）
• 1.3 L-天冬酰胺酶简介
• 1.4 L-天冬酰胺酶的分离纯化
• 1.5 本课题研究的内容
• 第2章 高压匀浆破释放L—天冬酰胺酶
• 2.1 实验试剂
• 2.2 主要实验设备及仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 大肠杆菌菌体培养
• 2.3.2 高压匀浆破碎菌体细胞释放L—天冬酰胺酶
• 2.3.3 原液收集
• 2.3.4 分析方法
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 匀浆操作压力对细胞破碎过程的影响
• 2.4.2 高压匀浆的悬浮液体对L—天冬酰胺酶活性的影响
• 2.5 小结
• 第3章 双水相成相物对L—天冬酰胺酶在高压匀浆体系中的酶活特性的影响
• 3.1 实验试剂
• 3.2 实验设备及仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 大肠杆菌菌体培养
• 3.3.2 高压匀浆破碎菌体细胞释放L-天冬酰胺酶
• 3.3.3 菌体收集
• 3.3.4 双水相成相物对L—天冬酰胺酶在高压匀浆体系中的酶活性特性释放
• 3.3.5 L—天冬酰胺酶及蛋白质总量分析方法
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 成相聚合物对L—天冬酰胺酶活性释放的影响
• 2PO4和K₂HPO₄混合溶液对L—天冬酰胺酶活性释放的影响'>3.4.2 KH₂PO4和K₂HPO₄混合溶液对L—天冬酰胺酶活性释放的影响
• 3.5 小结
• 第4章 PEO-PPO-PEO/KHP双水相耦合高压匀浆技术释放L—天冬酰胺酶
• 4.1 实验试剂
• 4.2 实验设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 大肠杆菌菌体菌体收集及粗酶制备
• 4.3.2 L—天冬酰胺酶的分配系数
• 4.3.3 回收PEO-PPO-PEO
• 4.3.4 L—天冬酰胺酶在HPH耦合PEO-PPO-PEO/KHP双水相体系的释放
• 4.3.5 分析
• 4.3.6 公式
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 L—天冬酰胺酶在PEO-PPO-PEO/KHP双水相释放
• 4.4.2 PEO-PPO-PEO聚合物的回收
• 4.4.3 L—天冬酰胺酶在高压匀浆耦合双水相萃取技术释放特性
• 4.5 双水相萃取（ATPE）耦合高压匀浆（HPH）
• 4.6 小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 本论文的主要结论
• 5.2 后续研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果