鹅肠道细菌多样性的分子生态学初步研究

论文摘要

鹅肠道菌群一个非常复杂的微生态组织,其对鹅的健康和营养物质的消化吸收起着关键性作用。目前对家禽肠道菌群的研究较少,而在鹅方面的研究还未见报道。随着分子生物学方法的发展,单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）等分子生物学方法在微生物多样性方面得到了越来越广泛的应用。本研究以鹅为试验材料,对鹅各个肠段内容物中的微生物总DNA的8种细菌裂解方法进行了筛选,通过对SSCP条件的摸索,得出最佳的SSCP电泳条件,并采用PCR-DGGE技术,初步探索了鹅各个肠段的菌群组成。结果显示:1、在8种细胞裂解方法中,酶和反复冻融相结合的方法能最好地将鹅各个肠段内容物中鹅微生物总DNA提取出来,并通过前处理如加入PVP及差速离心等方法去除了肠道内的色素及各种杂质,从而减少了对DNA提取的干扰。而提取成功与否的关键在于加入的各种试剂如SDS、CTAB、溶菌酶、蛋白酶K等的终浓度。2、实验发现不同的凝胶组成、是否加甘油、尿素和λ-核酸外切酶、电泳温度、电压等因素都会对SSCP电泳的结果产生影响。经过对各种凝胶和电泳条件的比较,得出了针对本实验样品的最佳优化条件:凝胶浓度为12%,胶联度为39:1,凝胶中不加甘油,电泳电压为120 V,在恒温环境中,试验重复性较好,条带较清晰。3、根据以上得到的最佳SSCP电泳条件,对不同DNA提取方法得到的8个盲肠样经过扩增后进行SSCP电泳,并切下清晰的条带进行克隆测序,得到了盲肠中含有一种与Uncultured bacterium同源性高达97%的细菌。4、根据细菌通用引物对鹅各个肠段基因组DNA进行PCR扩增,再利用DGGE对扩增得到的16S rRNA序列进行分离。采用40%-60%的变性剂浓度范围进行变性梯度凝胶电泳,在凝胶不同位置分离出100多条不同的16S rRNA条带,较亮带73条,最后通过测序得到的条带数为41条。序列比对表明,鹅肠道细菌与假单胞菌,无芽孢杆菌,伯克霍尔德氏菌,微球菌,罗氏菌属,嗜热菌,植物内生菌,鹧鸪梭菌,双岐杆菌同源性较高,达94%-99%。由此可见,以DGGE技术分离16S rRNA条带研究鹅肠道细菌多样性是可行的。5、在SSCP与DGGE的比较研究中,两种方法获得的细菌多样性图谱不同,两种方法都有一定的选择性和局限性,而DGGE相对于SSCP能更好地分离鹅肠道菌群,能更好地反应鹅肠道菌群多样性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 肠道微生物的研究进展
• 2 肠道微生物的分子生物学分析方法
• 2.1 DNA 提取技术
• 2.1.1 土壤中微生物总DNA 的提取
• 2.1.2 植物微生物总DNA的提取
• 2.1.3 粪便微生物总DNA的提取
• 2.1.4 瘤胃微生物总DNA的提取
• 2.1.5 肠道微生物总DNA的提取
• 2.1.6 DNA 的纯化
• 2.2 用于菌群多样性研究的分子生物学技术
• 2.2.1 16S rRNA 序列分析
• 2.2.2 16S-23S rRNA 基因序列分析
• 2.2.3 核酸杂交技术
• 2.2.4 PCR-RFLP/T-RFLP 技术
• 2.2.5 RAPD（随机多态性DNA）
• 2.2.6 PCR-SSCP 技术
• 2.2.7 PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）
• 3 本研究的意义和主要内容
• 参考文献
• 第二章 用于鹅肠道细菌区系分子生态学研究核酸提取方法的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 样品处理
• 1.3 细胞裂解方法
• 1.4 肠道微生物总DNA的定量和纯度检测
• 1.5 PCR 扩增和产物的检测
• 1.6 变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）
• 1.6.1 变性胶的制备
• 1.6.2 PCR 样品的加样
• 1.6.3 电泳及染色
• 2 实验仪器及试剂
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂及配制方法
• 3 结果
• 3.1 8 种细胞裂解方法获得的核酸的浓度和纯度的比较
• 3.2 8 种细胞裂解方法所用的步骤、时间、成本费的比较
• 3.3 肠道微生物总 DNA 的 PCR 扩增
• 3.4 不同细胞裂解方法获得的核酸PCR产物的DGGE图谱分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 第三章 鹅肠道细菌区系的 SSCP 体系构建
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 PCR 反应体系及程序
• 1.3 单链构象多态性（Single-Strand-Conformation Polymorphism，SSCP）
• 1.3.1 电泳装置的准备
• 1.3.2 凝胶的制备
• 1.3.3 SSCP
• 1.3.4 银染
• 1.3.5 λ-核酸外切酶切除反义链的步骤
• 1.4 SSCP 胶上分离的16S rRNA 条带的回收及二次 PCR
• 1.5 PCR 产物的克隆
• 1.5.1 感受态大肠杆菌的制备
• 1.5.2 DNA 片段的连接
• 1.5.3 连接产物转化感受态大肠杆菌
• 1.5.4 挑选白色单菌落
• 1.5.5 质粒提取步骤
• 1.5.6 重组子的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 SSCP 条件的摸索
• 2.2 单链构象多态性电泳（SSCP）分析及片段的克隆测序
• 3 讨论
• 3.1 SSCP 条件的摸索
• 3.2 SSCP 方法的探讨
• 4 小结
• 参考文献
• 第四章 应用变性梯度凝胶电泳研究鹅肠道细菌菌群的多样性
• 1 材料与方法
• 1.1 样品的采集和处理
• 1.2 实验仪器及试剂
• 1.2.1 主要仪器设备
• 1.2.2 主要试剂
• 1.3 PCR 引物序列
• 1.4 16S rRNA 片段的 PCR 扩增
• 1.4.1 PCR 扩增反应体系
• 1.4.2 PCR 扩增反应程序
• 1.4.3 PCR 产物检测
• 1.5 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 1.5.1 变性梯度凝胶的制备
• 1.5.2 灌胶，电泳与染色
• 1.6 DGGE 胶上分离的16S rRNA 条带的回收
• 1.7 16S rRNA 片段的 PCR 再扩增
• 1.8 测序与序列分析
• 2 结果与结论
• 2.1 5 个肠道 DNA 样的 PCR 扩增
• 2.2 DGGE 指纹图谱的建立及分析
• 2.3 16S rRNA 的再扩增及测序结果
• 2.4 基于16S rRNA 序列的同源性分析及系统发育树分析
• 2.4.1 十二指肠内优势菌群的组成与系统发育树分析
• 2.4.2 空肠内优势菌群的组成与系统发育树分析
• 2.4.3 回肠内优势菌群的组成与系统发育树分析
• 2.4.4 盲肠内优势菌群的组成
• 2.4.5 结肠内优势菌群的组成
• 2.5 不同肠段优势细菌的系统发育分析
• 2.6 研究方法的评价
• 3 小结
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录