不同NAD含量培养条件下APP毒力的研究及多价灭活疫苗的研制

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎(Porcine Pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae, APP)引起的一种常见的呼吸道传染病,各年龄的猪只均可感染。猪群感染胸膜肺炎放线杆菌后,主要表现为精神沉郁,体温升高,呼吸困难等临床症状,并出现特征性的出血性肺炎和胸膜炎。本病在世界各养猪国家普遍存在,近年来,流行日趋严重,成为大规模养猪的五大疫病之一。本研究共分为两大部分:第一部分:不同NAD含量条件下培养的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌对小白鼠的致病性和免疫保护性。将在含有0.05%(V/V)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide ademine dinucleotide, NAD)和0.001%(V/V)NAD的LB平板(lauria broth, LB)培养基中培养的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP),分别以3×10~9CFU/只的菌量对30日龄小白鼠进行接种,观察不同NAD含量条件下培养的APP对小白鼠的致病性。结果表明:含0.001%(V/V)NAD条件下培养的血清5型APP对小白鼠的致病性较强,小白鼠接种APP后,多数表现肺脏严重出血;而含0.05%(V/V)NAD条件下培养的血清5型APP接种小白鼠后,只有少数肺脏出血严重,多数表现为轻度出血。将上述培养的APP按常规方法制备油乳剂灭活疫苗,将制备的灭活疫苗分别在第3周龄和第6周龄对小白鼠进行免疫接种,在2免后3周分别对免疫的小白鼠进行同源攻击,并对免疫前后小白鼠的抗体效价进行检测。结果表明:含0.001%(V/V)NAD条件下培养的血清5型APP制备的灭活疫苗对小白鼠的保护率与含0.05%(V/V)NAD条件下培养的血清5型APP制备的灭活疫苗对小白鼠的保护率差异不显著,但含0.001%(V/V)NAD条件下培养的血清5型APP制备的灭活疫苗免疫小白鼠,用血清5型APP同源攻击后,发病的小白鼠肺脏出血较轻,而含0.05%(V/V)NAD条件下培养的血清5型APP制备的灭活疫苗免疫小白鼠攻毒后,发病的小白鼠肺脏出血严重。可见在不同NAD含量条件下培养的APP对小白鼠的致病性和免疫保护力不同,在含NAD较少的培养基中培养的APP制备的油佐剂灭活疫苗对小白鼠的保护力较强。第二部分:猪胸膜肺炎放线杆菌油佐剂多价灭活疫苗的制备及对小白鼠的保护力根据适当降低培养基中NAD的含量可以增加APP灭活疫苗保护力的研究结果,我们将从山东地区分离鉴定的血清1、3、5、7型APP经培养灭活后按照等体积进行混和并加入适量油佐剂按照常规方法制备油佐剂多价灭活疫苗,将制备的灭活疫苗以0.3mL/只的剂量分别在第3周龄和第5周龄对小白鼠进行免疫接种,在二免后3周分别对免疫组和对照组小白鼠进行同源攻击,结果,制备的油佐剂多价灭活疫苗对4种血清型APP攻击的保护率分别达到91.7%、100%、91.7%和91.7%,二次免疫后3周小白鼠血清抗体水平最高,ELISA检测450nm下小鼠血清抗体OD值接近0.6,初次免疫10周后小白鼠血清抗体450nm下OD值仍然维持在0.4以上。结果表明,制备的油佐剂多价灭活疫苗对小白鼠具有较好的安全性和较强的免疫保护力,从而为进一步研制猪用商品灭活疫苗打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 病原学
• 1.1 病原特征
• 1.2 致病因子
• 2.猪胸膜肺炎流行病学研究
• 3.猪胸膜肺炎放线杆菌诊断方法
• 3.1 细菌的分离鉴定
• 3.2 血清学诊断
• 3.3 分子生物学诊断
• 4. 猪胸膜肺炎放线杆菌免疫预防
• 4.1 活疫苗
• 4.2 灭活苗
• 4.3 亚单位苗
• 4.4 基因工程弱毒活疫苗
• 试验一 不同NAD含量条件下培养的血清5型APP对小白鼠的致病性和免疫保护性
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 试验动物
• 1.4 APP 的培养
• 1.5 小鼠致病性试验
• 1.6 疫苗的制备
• 1.7 免疫接种与攻毒
• 1.8 间接ELISA 方法检测小白鼠血清抗体
• 2 结果与分析
• 2.1 致病性试验结果
• 2.2 免疫保护试验结果
• 2.3 小白鼠血清抗体检测结果
• 3 讨论
• 试验二 猪胸膜肺炎放线杆菌油佐剂多价灭活疫苗的制备及对小鼠的保护力
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 试验动物
• 1.4 油佐剂多价灭活疫苗的制备
• 1.5 油佐剂多价灭活疫苗的检验
• 1.6 最佳免疫剂量测定
• 1.7 免疫效力测定
• 1.8 小白鼠血清抗体水平消长规律
• 2 结果
• 2.1 灭活试验结果
• 2.2 无菌检验结果
• 2.3 安全性检验结果
• 2.4 稳定性检验结果
• 2.5 保存期检验结果
• 2.6 最佳免疫剂量测定结果
• 2.7 免疫效力测定结果
• 2.8 免疫小鼠血清抗体消长规律
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文情况