钙调磷酸酶调节蛋白1（RCAN1）与NF-κB相互作用机制及其影响白血病细胞活力的研究

论文摘要

核转录因子-κB属于核转录因子家族,这些转录因子和逆转录癌基因蛋白v-Rel具有同源性。在急性淋巴细胞性白血病（ALL）,急性髓系白血病（AML）,霍奇金氏淋巴瘤等这些血癌以及其他多种实体瘤中,NF-кB的活性处于一个非正常的高水平（1-4）。被激活的NF-кB具有抗凋亡的作用,并且被认为是多种肿瘤的一种关键存活因子（5,6）。在TEL-JAK2转基因鼠的人类T-ALL模型中（7）,NF-кB的缺失缓解了白血病的发生。在白血病模型鼠以及人类ALL细胞中,抑制了NF-κB的信号通路将有效的抑制了肿瘤的生成（8）。对NF-кB信号通路的抑制作用被认为是那些皮脂性,非皮脂性抗炎症药物和天然及合成的化合物用于治疗和防治肿瘤的重要机制。哺乳动物中NF-кB的家族由五个成员组成,分别为NF-кB1 （p50）, NF-кB2 （p52）, RelA （p65）, RelB和C-Rel,这些家族成员分别组成了多种同源或异源的二聚体（9）。NF-кB的抑制子IкBs对NF-кB的活性有紧密调节作用（10）。IкBs结合到NF-κB的二聚体上,从空间上遮掩了它们的核定为序列,导致NF-кB滞留在胞浆内。当细胞被肿瘤坏死因子TNFa （tumor necrosis factor a,TNFa）和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）等刺激物激活时（11,12）,IкBα的第32和36位丝氨酸残基保守位点被磷酸化,磷酸化后的IкBα将被泛素化,随之被蛋白酶体降解（13）。IкBα被蛋白酶体降解后,NF-кB二聚体将被释放,并转移到细胞核内,接着进行目的基因的转录调控（9）。另一种NF-кB激活机制为IKBa第42位络氨酸的磷酸化（14,15）,有的研究表明第42位络氨酸磷酸化后IкBα会被降解,有的则显示IкBa不会被降解（15-17）。在唐氏综合症关键区域（Down Syndrome Critical Region, DSCR）（18,19）中首次被发现的基因,钙调磷酸酶调节蛋白RCAN 1 （regulator of calcineurin 1,RCAN 1）,能与神经钙调节蛋白calcineurin亚基A相互作用,由此抑制了calcineurin在体内和体外的活性（20-24）。有趣的是,RCAN1不仅能通过抑制calcineurin的活性来抑制NFAT的信号通路（25）,而且能被calcineurin-NFAT信号通路激活,例如钙离子,VEGF,血管紧张素Ⅱ, TNF-a等（26,27）,由此RCAN1的基因调控形成了负反馈调节。这种紧而有序的RCAN1负反馈调节预示着RCAN1在细胞功能的调节有重要作用。最近的一些研究表明,RCAN1与癌症相关联。在单拷贝RCAN1转基因小鼠中,RCAN1能有效地抑制肿瘤生长,这种抑制作用是由于calcineurn信号通路被抑制,以至于在肿瘤生长中血管生成被抑制（28,29）。因此,可以合理的推测cyclosporin A和FK506,以及能特异性抑制calcineurin的免疫反应抑制药,将会抑制肿瘤血管的生成。然而,奇怪的是,许多临床研究显示,一些患者在进行一系列复杂的移植并接受长期的免疫抑制治疗后,他们患癌症的概率明显增高（30）。到目前为止,这种具体机制尚未清楚,然而,这些研究预示着RCAN1除了抑制calcineurin信号参与了肿瘤发生外,将还会有一种新的机制参与肿瘤发生。由于在癌症中NF-кB有重要作用,因此我们将研究RCAN1和NF-кB在肿瘤的发生中是否有相关作用。在我们的研究中,我们发现RCAN1能抑制NF-кB的活性。具体机制为RCAN1能与IKBa相互作用,并且减少了IKBa在第42位络氨酸的磷酸化。在急性白血病细胞系和原代急性白血病细胞中感染了表达RCAN1腺病毒,细胞活力试验检测得到RCAN1的过量表达降低了这些细胞的活力。有趣的是,我们还发现RCAN1能被NF-кB信号通路上调。在RCAN1.4的启动子上有NF-кB效应元件。我们的研究预示了白血病的一个新的基因治疗方法,通过激活RCAN1而抑制NF-κB的活性,由此抑制了细胞的活力。

论文目录

• 目录
• TABLE OF CONTENTS
• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1. 核转录因子NF-κB
• 1.1.1. 核转录因子NF-κB的组成和功能
• 1.1.2. 核转录因子NF-κB的激活
• 1.1.3. 核转录因子NF-κB的调节
• 1.1.4. NF-κB的生物功能作用
• 1.1.4.1. NF-κB与细胞凋亡
• 1.1.4.2. NF-κB和免疫应答作用
• 1.1.4.3. NF-κB和肿瘤
• 1.2. RCAN1基因
• 1.2.1. RCAN1的发现
• 1.2.2. RCAN1的基因家族
• 1.2.3. RCAN1在细胞内的功能
• 1.2.3.1. RCAN1对Calcineruin的双重调节作用
• 1.2.3.2. RCAN1与SOD1的调控
• 1.2.3.3. RCAN1与NF-κB信号通路
• 1.2.4. RCAN1与疾病
• 1.2.4.1. RCAN1与氧化应激
• 1.2.4.2. RCAN1与神经元凋亡
• 1.2.4.3. RCAN1与心肌肥大
• 1.2.4.4. RCAN1与血管发生
• 1.2.4.5. RCAN 1和DS
• 1.2.4.6. RCAN1与AD
• 1.2.4.7. RCAN1与肿瘤
• 第二章 材料与方法
• 2.1. 质粒的构建
• 2.1.1. RCAN1启动子质粒的构建
• 2.1.2. RCAN1-NF-κB质粒的构建
• 2.1.3. 定点突变RCAN1启动子质粒的构建
• 2.1.4. 病毒质粒构建
• 2.2. 细胞培养
• 2.2.1. 细胞培养基的制备
• 2.2.2. 细胞的消化
• 2.3. 细胞转染
• 2.4. 双荧光素酶活性检测
• 2.5. 反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）
• 2.5.1. 细胞的制备
• 2.5.2. RNA的提取
• 2.5.3. cDNA的合成
• 2.5.4. 半定量-PCR（Semi-Quantification-PCR）
• 2.5.5. 实时定量-PCR（Real time Quantification-PCR）
• 2.6. Western Blotting
• 2.7. 免疫共沉淀（CO-IP）
• 2.8. 腺病毒的包装和感染
• 2.9. 细胞活力检测
• 2.10. 细胞凋亡的检测
• 2.11. 核蛋白的提取和EMSA实验
• 2.11.1. 核蛋白的提取
• 2.11.2. EMSA实验
• 2.12. 原代细胞的分离
• 第三章 实验结果
• 3.1. RCAN1抑制NFκB的活性
• 3.1.1. RCAN1抑制NF-κB的荧光素酶活性
• 3.1.2. RCAN1抑制NF-κB入核
• 3.1.3. RCAN1抑制NF-κB结合活性
• 3.2. RCAN1能增加IκBα的稳定性并与其具有蛋白间的相互作用
• 3.2.1. RCAN1的增加了IκBα的稳定性
• 3.2.2. RCAN1的敲除促进IκBα第42位的络氨酸残基磷酸化
• 3.2.3. RCAN1与IκBα具有相互作用
• 3.3. RCAN1的诱导了急性白血病细胞系和原代急性白血病细胞的凋亡
• 3.3.1. RCAN1抑制了急性白血病细胞系中NF-κB的活性
• 3.3.2. RCAN1降低了急性白血病细胞系的活力
• 3.3.3. RCAN1降低了急性白血病细胞系的活力
• 3.3.4. RCAN1诱导了急性白血病细胞系Caspase活性
• 3.4. NF-κB对RCAN1的调节
• 3.4.1. NF-κB能特异性上调RCAN1.4,而不能上调RCAN1.1的表达
• 3.4.2. NF-κB能上调RCAN1.4启动子活性
• 3.4.3. RCAN1.4启动子上NF-κB效应元件的识别
• 第四章 讨论与总结
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况
• 外文论文