论文摘要
第一部分TLR3在A549细胞中的表达目的：Toll样受体家族（Toll-like receptors，TLRs）是非常重要的天然免疫分子，并被视为联系天然免疫和获得性免疫的桥梁，近年来随着天然免疫研究的不断发展，人们逐渐关注TLRs和机体肿瘤的关系。本研究旨在探讨TLR3在人肺腺癌细胞（A549细胞）和人支气管上皮细胞（HBE细胞）中的表达情况及意义。方法：体外培养A549细胞和HBE细胞，分别采用细胞免疫组化技术、实时定量PCR（Real-time Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction，Real-Time Quantitative PCR）及western blot检测TLR3mRNA和蛋白在2种细胞中表达的差异。结果：细胞免疫组化染色，TLR3主要表达于2种细胞的细胞膜和胞浆中，成棕黄色颗粒状，A549细胞中TLR3mRNA的表达高于HBE细胞，TLR3蛋白在A549细胞中的表达高于HBE细胞。（p＜0.01）结论：TLR3在A549细胞中表达高于HBE细胞，提示TLR3可能参与促进人肺腺癌细胞的生长进展过程，具体机制有待进一步深入研究。第二部分TLR3基因RNAi慢病毒载体的构建目的：观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰（RNAi）对人肺腺癌细胞株A549细胞Toll样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）表达的影响，为后续的以TLR3基因为靶点的肺癌研究和治疗奠定基础。方法：应用基因工程技术，筛选出4条针针对TLR3基因的RNAi靶序列，分别与pCCL-CFP载体连接，构建4个重组慢病毒表达载体TLR3-RNAi-LV 1#，TLR3-RNAi-LV 2#，TLR3-RNAi-LV 3#，TLR3-RNAi-LV 4#；将连接产物转化到DHSα感受态细胞，经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将TLR3-RNAi-LV、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将包装产生的4种重组慢病毒分别感染A549细胞，实时定量PCR和Western印迹检测A549细胞TLR3 mRNA和蛋白的表达，并与未转染及空转染细胞进行比较。结果：4个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致，经包装产生的病毒滴度分别为2E+8、2E+8、2E+8、1E+8 TU／ml。感染A549细胞后，TLR3基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降（P＜0.05），其中TLR3-RNAi-LV 4#作用较明显，使mRNA表达下降80％，蛋白表达下降68％（P＜0.05）。结论：成功构建针对TLR3基因的4个慢病毒载体TLR3-RNAi-LV，体外感染A549细胞后可有效抑制TLR3基因和蛋白的表达。第三部分转染TLR3-RNAi慢病毒载体对A549细胞增殖及免疫逃逸的影响目的：探讨通过RNA干扰技术，使人肺腺癌细胞中TLR3的表达发生变化，对人肺腺癌细胞的增殖、抗凋亡及免疫逃逸方面的影响。方法：利用第二部分实验构建并筛选出的TLR3-RNAi慢病毒载体，转染A549细胞，建立TLR3基因沉默的人肺腺癌稳转细胞株，同时给予慢病毒转染组、未转染组和阴性对照组TLR3的配体Poly（I：C）刺激后，分别通过流式细胞术检测B7-H1的表达，实时定量PCR方法检测PGE-2的表达，western blot方法检测磷酸化P38的含量，以及用Annexin V／PI双染色法检测A549细胞的凋亡。结果：在Poly（I：C）刺激时间及浓度相同的情况下，转染TLR3-RNAi慢病毒载体的A549细胞组中B7-H1阳性细胞百分比为23.35±0.071％，未转染慢病毒载体组为55.25±0.015％，阴性对照组为48.75±0.020％，慢病毒转染组明显小于未转染组及阴性对照组（p＜0.01）；运用2-△△Ct数据分析法，转染TLR3-RNAi慢病毒载体的A549细胞组中PGE-2表达明显少于未转染慢病毒载体组及阴性对照组（p＜0.01）；转染TLR3-RNAi慢病毒载体的A549细胞组中磷酸化P38的百分比相对值为6.37±0.28％，未转染慢病毒载体组中磷酸化P38的百分比相对值为33.63±6.752％，阴性对照组中磷酸化P38的百分比相对值为17.36±2.24％，病毒载体转染组磷酸化P38的含量明显低于未转染慢病毒载体组及阴性对照组（p＜0.01）；凋亡实验显示，转染TLR3-RNAi慢病毒载体的A549细胞组细胞凋亡率为44.4±1.41％，未转染慢病毒载体组细胞凋亡率为34.7±0.89％，阴性对照组细胞凋亡率为36.5±1.12％，慢病毒转染组明显高于未转染慢病毒载体组和阴性对照组。（P＜0.01），结论：TLR3基因沉默抑制了A549细胞中P38、PGE-2、B7-H1的表达，并降低了细胞的抗凋亡能力。
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