论文摘要
牦牛是青藏高原及其毗邻地区不可或缺的全能家畜,对高寒气候等恶劣环境有极强的适应性,但其生产性能较低。为了提高牦牛的生产性能,我国从上世纪50年代开始采用良种黄牛与牦牛进行杂交,杂种一代犏牛表现出很强的杂种优势,但其雄性不育使得杂种优势的利用受到了极大的限制,成为牦牛杂交改良的“拦路虎”。为了探讨犏牛雄性不育问题,本研究以成年健康雄性犏牛、黄牛和牦牛为研究对象,运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得牦牛印记基因或精子发生相关基因差异甲基化区（DMR）序列,利用Real-time PCR技术检测了这些基因在犏牛及其亲本睾丸组织中的表达差异,运用亚硫酸氢钠测序法检测了相关基因DMR甲基化状态,为研究犏牛雄性不育与DNA甲基化的关系提供理论基础。1.牦牛H19/IGF2（?）记控制区（ICR）的分子克隆及序列分析本实验根据黄牛H19基因DNA序列NW001494548设计引物扩增出牦牛H19基因长约6.5kb的序列（GenBank登录号：EU502716）,该序列包含完整的印记控制区（ICR）、启动子和部分第一外显子。用生物信息学方法,将该序列与黄牛、绵羊猪、人类和小鼠的相应序列比对分析,发现牦牛与他们的相似度分别为97%、83.13%、48%、47%、42%；该扩增序列中共有6个CpG岛,长度分别为1182、1186、707、277、281和1311bp；有6个锌指蛋白CTCF结合位点,均位于CpG岛内,分别定位于转录起始部位上游5.5kb、5.1kb、4.1kb、3.7kb、2.7kb和1.3kb；H19基因5′端存在核心启动子区,TATA box、GC box及Sp1、Sp2、AP2、NF-κB、STAT5、P53、 WT1、GFI1、MTBP、CPBP、ZF9、E2F知Myc-Max等识别位点。2.犏牛及其亲本睾丸组织中H19基因mRNA表达水平、DNA甲基化状态差异分析本实验运用Real-time PCR技术对犏牛及其亲本睾丸组织中H19基因表达水平进行了分析,结果发现,犏牛的表达水平极显著高于黄牛和牦牛（P<0.01）,而黄牛和牦牛两者之间表达差异不显著（P>0.05）。采用亚硫酸氢钠测序法检测了包含CTCF结合位点3（CTCF-binding site III）的H19ICR的甲基化状态,结果发现,犏牛H19ICR的甲基化水平（48.82%）极显著低于黄牛（70%）（P<0.01）,显著低于牦牛（59.10%）（P<0.05）,但黄牛的甲基化水平显著高于牦牛（P<0.05）；犏牛CTCF结合位点3的甲基化水平（48.33%）极显著低于黄牛（75%）和牦牛（68%）（P<0.01）。说明H19ICR及ICR中的CTCF结合位点对H19基因表达调节具有重要作用。3.犏牛及其亲本睾丸组织中IGF2基因mRNA表达水平、DNA甲基化状态差异分析本实验根据黄牛IGF2基因组序列DQ298740设计引物扩增出了牦牛IGF2基因第十外显子部分序列,GenBank登陆号为FJ152104；通过Real-time PCR检测了犏牛及其亲本睾丸组织中IGF2基因的表达水平,运用亚硫酸氢钠测序法检测了睾丸组织中IGF2基因第十外显子DMR的甲基化状态。结果发现,犏牛睾丸组织中IGF2基因mRNA表达水平最低,与亲本的表达水平差异极显著（P<0.01）；黄牛、牦牛和犏牛睾丸中IGF2DMR的甲基化水平分别为90%、90.7%和92.0%,三组之间均未见显著差异（P>0.05）。实验结果说明IGF2基因mRNA表达水平与牛精子发生有关,可能在牛的精子发生过程中发挥重要作用,并可能与犏牛雄性不育有关；IGF2基因第十外显子DMR区的甲基化与IGF2基因在犏牛及其双亲睾丸中的表达差异无关,可能是其他的机制参与调节IGF2基因的表达。4.犏牛及其亲本睾丸组织中印记基因SNRPN的表达及DMR甲基化分析本实验根据黄牛SNRPN基因序列NW935049设计引物扩增出了牦牛SNRPN基因5′端序列,长为1137bp,与黄牛参照序列相似度达98.2%；经生物信息学分析,发现含有YY1和SP1等甲基化敏感位点。通过Real-time PCR检测了犏牛及其亲本睾丸组织中SNRPN基因的表达水平,运用亚硫酸氢钠测序法检测了睾丸组织中SNRPN基因5′端DMR的甲基化状态。结果发现,黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中SNRPN基因mRNA表达差异不显著（P>0.05）,但黄牛和牦牛SNRPN基因的表达高于犏牛；犏牛SNRPN DMR的甲基化水平（38.53%）极显著高于黄牛（21.08%）和牦牛（20.81%）的（P<0.01）。说明犏牛SNRPN DMR区的高甲基化本身还不足以引起SNRPN基因表达水平的显著变化,还有其它机制参与SNRPN基因的表达调节。5. DAZL基因5′端CpG岛DNA甲基化水平及其与犏牛雄性不育的关系研究前期研究发现LDAZL基因与犏牛雄性不育相关,是犏牛雄性不育的候选基因。为了进一步研究调控DAZL基因表达的机制,本实验根据黄牛DAZL基因序列（NC007299, complement:141791034..141818671）设计引物扩增了牦牛DAZL基因的5′端序列,并对牦牛、黄牛和犏牛DAZL基因的甲基化水平进行了分析,结果发现：牦牛DAZL基因的5′端存在CpG岛,CpG岛长1744bp（EU686694：650-2393）,包含启动子区、第一外显子和第一内含子；犏牛DAZL5′端DNA甲基化水平（85.6%）极显著高于黄牛（71.4%）和牦牛（69.8%）（P<0.01）。可见犏牛LDAZL基因的高甲基化与其nRNA表达缺乏、雄性不育的表型是一致的,说明DAZL基因的甲基化对DAZL基因mRNA的表达调控起重要作用,可能对犏牛生精细胞减数分裂、雄性不育有重要影响。