人呼吸道合胞病毒融合蛋白真核表达及纯化

论文摘要

目的:人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus,RSV）广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染最重要的病毒病原。目前尚无特异性防治方法,世界卫生组织将发展RSV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。在RSV所编码的11种蛋白中,融合蛋白（fusion protein, F）为跨膜糖蛋白,直接介导病毒与细胞的融合、病毒的穿入、合胞体的形成,而且F蛋白在RSV不同亚型间具有高度的抗原同源性,是主要的交叉保护性抗原,同时还有细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别的抗原表位。本研究尝试采用重组真核表达载体,瞬时转染COS-7细胞表达RSV F蛋白,利用操作简易、纯化效率高的Ni柱亲和层析法完成制备和纯化,获得高纯度、μg级的F蛋白,为进一步的诊断试剂及疫苗等研究奠定基础。方法:根据编码F蛋白的基因序列设计并合成引物,以本实验室保存的含有F基因的质粒pGEM3zf-F为模板,利用PCR方法,扩增出3′端带His标签和凝血酶裂解位点的F基因序列,克隆入pGEM-T easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,48 h后用RT-PCR鉴定基因转录,72 h后再用Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达和分布。Ni柱亲和层析法纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度。结果:核酸序列分析证实获得带His标签的RSV F基因序列,没有发生无义突变。真核表达载体pcDNA3.1（+）/F-His的限制性内切酶分析结果与预期一致。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析观察到F蛋白特异性的表达条带,间接免疫荧光实验观察到F蛋白主要呈膜及胞浆分布。Ni柱法F-His蛋白纯化回收率约为14.1%,高效毛细管电泳分析显示纯化后的F蛋白纯度达99%以上。结论:初步建立了RSV F蛋白真核表达及纯化方法,为进一步优化RSV F蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础。

论文目录

• 中英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 实验设计与流程
• 1 前言
• 2 实验材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献