论文摘要
目的:本研究旨在观察不同缺血时间窗缺血后适应（IPC）对心肌缺血再灌注（I/R）损伤的影响以及IPC心肌保护作用的相关影响因素,并进一步探讨再灌注损伤抢救激酶（RISK）在IPC减少心肌再灌注损伤中的作用机制。本研究包括:1)建立小鼠在体IPC模型,观察不同缺血时间窗IPC对心肌缺血再灌注损伤的影响,探讨IPC心肌保护作用最佳时机以及与缺血预适应（IP）的关系。2)建立小鼠离体心脏Langendorff缺血再灌注模型,探讨IPC对离体小鼠心肌再灌注损伤的作用以及与凋亡相关基因Bcl-2、Bax的关系。3)探讨再灌注损伤抢救激酶ERK1/2作为Bcl-2与Bax的上游靶酶在IPC减少心肌缺血再灌注细胞凋亡中的作用。方法:课题第一部分:1)选择成年120只C57BL小鼠,建立在体小鼠心肌缺血再灌注模型,随机分为缺血时间30min、45min和60min,每一缺血时间又分为IPC和I/R注两种处理,之后再灌注3h。通过开胸结扎左冠状动脉造成急性心肌梗死,在完全再灌注早期给予反复短暂再通/闭塞的IPC。采用伊文氏兰（Evans blue）和三苯基氯化四氮唑（TTC）染色的方法确定缺血心肌和梗死心肌面积,并测定血清的肌酸激酶（CK）的含量、血流动力学指标、心肌超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量。2)选择成年120只C57BL小鼠,建立在体小鼠心肌缺血再灌注模型,随机分成如下6组,均接受心肌缺血30min（假手术组除外）。①I/R组;②3次IPC组:再灌注前进行缺血10s,再灌注10s,此为一个循环,共计3个后适应循环;③6次IPC组:再灌注前进行6个后适应循环;④延迟IPC组:恢复再灌注1min后进行3次后适应循环;⑤IPC+IP组:在心梗模型建立前,短暂缺血5min后恢复血流10min,再完成30min的缺血,之后处理同3次IPC组,随后再灌注3h;⑥假手术组。分别测定梗死心肌面积、血清CK、血流动力学指标、心肌MDA水平以及SOD活性。课题第二部分:1)建立并改良小鼠离体心脏Langendorff灌流模型,72只成年C57BL小鼠均进行稳定灌流30min,随机分为3组:①IPC组:停止灌流30min,在完全再灌注早期给予反复短暂灌流/停止灌流的后适应,之后持续180min的灌注;②I/R组:I/R组为停止灌流30min后直接恢复再灌注180min,在停止灌流前后不做任何特殊处理;③空白对照（Sham）:持续进行离体灌流,不加任何干预。测定梗死心肌面积,采用微型测压球囊同步记录心功能的变化,采用TUNEL法测定心肌细胞凋亡指数（AI）、RT-PCR方法测定左室心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA的表达,Western blot法测定左室心肌胞浆与胞膜Bcl-2、Bax蛋白水平以及线粒体细胞色素C（Cyt.C）的释放。课题第三部分:96只C57BL离体小鼠建立小鼠离体心脏Langendorff灌流模型,全心缺血30min后分成如下4组,随后再灌注3h:1)I/R组;2)IPC组;3)IPC加ERK1/2抑制剂PD98059组; 4)I/R加ERK1/2抑制剂PD98059组。观察梗死心肌面积、心肌细胞凋亡指数与心肌磷酸化ERK1/2、磷酸化PI3K-Akt表达水平的关系,并测定心肌组织胞浆与胞膜Bcl-2、Bax蛋白以及线粒体Cyt.C的释放。结果:1)不同缺血时间窗的在体再灌注实验中,缺血30minIPC组、缺血45minIPC组心肌梗死面积分别为19.4±2.0%、38.3±4.0%,分别显著小于缺血30min I/R组和缺血45min I/ R组（分别是41.4±3.9%,55.4±5.3%）,下降幅度分别为53.1%和31.2%,差异均具有统计学意义（P<0.05）,同时缺血30minIPC组与缺血45minIPC组可明显降低血清CK浓度、提高心肌组织SOD的活性、降低MDA含量以及改善血流动力学指标（P<0.05）;缺血60min IPC组梗死心肌面积较60minI/R组比较无明显降低,差异无统计学意义（P>0.05）。2)心肌接受缺血30min后,3次IPC组与6次IPC组分别与I/R组比较,心肌梗死面积减少,血清CK浓度降低,同时心肌SOD活性升高,心脏血流动力学显著改善。6次与3次后适应循环的保护作用相似,并没有因为增加预适应,IPC心脏保护作用有所增加,IPC仅在恢复再灌注的早期1min内有效。3)成功建立并改良了小鼠离体心脏Langendorff缺血后适应模型,IPC组的心肌梗死面积[（32.8±3. 8）%]较I/R组[（48.1±4.8）%]明显降低（P <0.05）,IPC组离体心脏血流动力学显著改善（P <0.05）;IPC组与I/R组比较,凋亡细胞显著减少[（14.5±2. 6）% vs （28.1±4.2）%,（P<0.05）];透视电镜观察发现IPC可减轻缺血再灌注引起的线粒体损伤;组织Bcl-2 mRNA表达显著增加,Bcl-2和Bax mRNA的比值也随之上调（P<0.05）;同时胞膜Bcl-2蛋白水平上升,Bcl-2/Bax蛋白的比值上调,线粒体Cyt.C释放减少; 4)与I/R组相比,IPC组心肌的ERK1/2磷酸化蛋白水平显著增高,PI3K-Akt磷酸化蛋白水平无明显变化,心肌再灌注细胞凋亡减少（P均<0.05）。PD98059能显著抑制IPC所引起的组织ERK1/2的磷酸化水平升高,并能消除IPC减少心肌再灌注损伤的大部分作用,同时胞膜Bcl-2蛋白水平下降以及线粒体Cyt.C释放增多。结论:1)小鼠心肌处于轻中度水平的缺血损伤,在恢复冠脉血流的早期施行IPC可以有效地减少心肌再灌注损伤,但随着缺血时间的延长和心肌损伤程度的加重,IPC的保护作用就明显减弱或消失;2)IPC的心肌保护作用只有在再灌注早期的1min内有效,延迟IPC没有产生类似的保护作用,并没有增加IPC的循环数而扩大其的保护作用,IPC与IP没有产生叠加的心脏保护作用;3)本研究建立并改良的小鼠离体心脏Langendorff缺血再灌注模型技术稳定可靠,并证实IPC能有效地降低灌注缺血再灌注损伤,IPC能明显减少心肌I/R损伤导致的心肌细胞凋亡,其分子机制与上调胞膜Bcl-2与Bax蛋白表达的比值以及减少线粒体Cyt.C的释放有关;4)再灌注损伤抢救激酶中ERK1/2信号通路参与介导了IPC减少缺血再灌注损伤的作用,ERK1/2作为上游靶酶参予调控了心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax的表达以及线粒体Cyt.C释放。
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