论文摘要
正常机体免疫系统通过免疫监视功能可发现并清除癌变的细胞,而肿瘤病人特别是晚期病人则表现为抗肿瘤免疫能力的低下。临床上通过给病人接种肿瘤疫苗或CTL细胞过继免疫的方法试图激发病人的抗肿瘤免疫能力以杀伤肿瘤,但是在实际应用中却发现肿瘤治疗效果有限。肿瘤病人免疫低下导致抗肿瘤免疫治疗不能达到理想效果,其主要原因是肿瘤细胞会持续不断地产生大量膜型和分泌型生物活性物质（tumor-derived factors,TDFs）,诱导多种免疫抑制性细胞产生,并在肿瘤内聚集,形成稳定的肿瘤免疫抑制微环境,进而保护肿瘤逃避机体的免疫攻击。在肿瘤免疫逃逸研究中,有两群免疫抑制细胞即髓系来源抑制性细胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSC）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）在其中起了主导作用,是目前肿瘤免疫研究中关注的热点。MDSC是由粒细胞、单核/巨噬细胞和处于早期分化阶段的髓系前体细胞组成的细胞群。正常生理情况下,MDSC主要集中在骨髓,但是在肿瘤、慢性感染、创伤应急、GVHD、辐照影响下,骨髓内MDSC可大量增殖,并向各组织器官聚集。肿瘤诱导的MDSC参与肿瘤免疫逃逸的认识,最早见于上世纪80年代Yong MR研究小组的报道。他们发现恶性Lewis肺癌在小鼠骨髓中诱导出一群具有免疫抑制功能的细胞亚群。后续又有大量的文献报道头颈部肿瘤,鳞状上皮癌,乳腺癌和小细胞性肺癌等患者外周血与肿瘤浸润组织存在大量的MDSC,切除肿瘤组织后,肿瘤病人外周血MDSC细胞数目降低。肿瘤动员的MDSC从骨髓进入外周血后,在肿瘤微环境的影响下可进一步分化发育成新的细胞亚群。我们实验室前期研究中发现外周常规髓系来源抑制细胞（conventional MDSC,cMSC）进入肿瘤后进一步分化为分化为新的亚群,分化髓系来源抑制细胞（differentiated MDSC,dMSC）。这群细胞膜表面低表达CD11b和Gr1,与cMSC相比,高分泌IL-6和高表达MMP9,具有很强的促肿瘤转移功能（未发表结果）。研究发现肿瘤组织内MDSC主要通过诱导机体免疫耐受促进肿瘤生长进展,进入肿瘤后还可进一步分化为血管内皮细胞,参与肿瘤血管的生成。可见,MDSC的肿瘤内聚集与肿瘤的生长进展密切相关,那么MDSC是如何在肿瘤内聚集的?哪些因子和信号通路参与了这一过程?对此我们还缺乏充分的认识。1980年Berendt等最先报道了肿瘤组织内存在一群具有抑制功能的T细胞亚群,但限于当时技术条件的限制,未能进一步找到这类T细胞的特异性标志物。直到1995年,日本学者Sakaguchi等找到了抑制性T细胞的膜表面标志CD4+CD25+,才提出调节性T细胞（regualtory T cells,Treg）概念,后续研究发现Treg特异表达转录因子Foxp3。临床已经证实多种癌症患者（如胰腺癌、胃肠道的恶性肿瘤、早期非小细胞肺癌和晚期的卵巢癌等）外周血和肿瘤病灶内有Treg细胞数量增多或比例增加现象。与MDSC类似,切除肿瘤后外周和肿瘤内Treg恢复到正常水平,而肿瘤复发时Treg水平又升高。小鼠纤维肉瘤肿瘤模型研究发现,Treg选择性的在肿瘤内聚集,进展性晚期肿瘤内浸润淋巴细胞主要为Treg细胞,肿瘤内注射抗CD4抗体清除CD4+T细胞,可显著增强抗肿瘤免疫应答,肿瘤病灶明显消退,该结果提示肿瘤诱导的Treg主要在肿瘤内发挥抑制效应。那么肿瘤内Treg是如何产生的?哪些信号通路参与了这一过程?目前还不是非常明确。死亡受体Fas,其主要功能为介导细胞凋亡,但其也可介导活化、增殖和炎症信号。我们实验室和其他研究室的研究证明,Fas活化后的DC可大量分泌炎性细胞因子和趋化因子,介导炎症反应。越来越多的证据表明慢性炎症与肿瘤免疫耐受的形成密切相关。那么肿瘤内的Fas信号是否也可介导炎症反应,影响机体的免疫功能呢?我们通过小鼠3LL肺癌为模型,研究了肿瘤内Fas信号对肿瘤生长以及机体免疫功能的影响,并对其相关机制进行了探讨。首先,我们检测了3LL小鼠肺癌细胞Fas的表达,RT-PCR和Western blot分析发现3LL细胞表达Fas。Fas活化型抗体Jo2（5μg/ml）刺激3LL细胞,发现3LL细胞对Jo2诱导凋亡抵抗。为体外研究Fas信号对3LL细胞生长增殖的影响,我们用Jo2和anti-mFasL中和性抗体处理3LL细胞,MTT法观察了3LL细胞的生长,发现Jo2和anti-mFasL对3LL细胞的体外增殖没有明显影响。为进一步观察体内肿瘤Fas信号对肿瘤生长的影响,我们复制了过表达Fas的肺癌模型。我们将编码Fas基因全长的Fas-WT和Fas基因胞内段缺失的Fas-DN真核表达质粒转染3LL肺癌细胞,通过G418加压筛选,有限稀释,流式细胞筛选的方法获得了稳定表达这两个基因的细胞株3LL/Fas-WT、3LL/Fas-DN。体外MTT法检测这两株细胞和3LL细胞生长增殖,发现与3LL细胞相比3LL/Fas-WT、3LL/Fas-DN生长增殖没有明显差异。随后我们将3LL/Fas-WT、3LL、3LL/Fas-DN这三株细胞接种到C57BL/6J小鼠皮下,观察了肿瘤生长和小鼠的生存情况。结果发现与3LL/Fas-DN,3LL两株细胞相比,过表达Fas的3LL/Fas-WT肿瘤生长迅速,相应的接种3LL/Fas-WT的荷瘤小鼠生存期显著降低。该结果表明,Fas信号可促进肺癌细胞的体内增殖、进展。那么,Fas信号介导肿瘤生长进展是否依赖于Fas配体FasL的活化呢?为此,我们又将三株肺癌细胞接种到FasL功能缺失的Tnfsf6gld（gld）小鼠,结果发现3LL/Fas-WT的生长优势消失,三组肿瘤生长大小和生存期差异不明显。该结果显示,Fas信号促进肺癌细胞3LL生长的作用需依赖于FasL。Fas信号体内可促进肿瘤的生长进展,而体外Jo2刺激3LL细胞,细胞生长增殖没有明显改变。那么Fas信号对肿瘤的促进作用是否是通过调节机体免疫功能而实现的呢?我们分析了3LL/Fas-WT、3LL、3LL/Fas-DN三株细胞接种C57BL/6J成瘤后第7天,第14天,肿瘤组织内免疫抑制细胞MDSC、Treg的浸润情况。免疫组织化学结果发现,接种肺癌细胞后第7天,肿瘤组织内可见Gr1+MDSC浸润,三组肿瘤中3LL/Fas-WT肿瘤组织内MDSC的浸润最为显著,但是未见Foxp3+Treg的浸润。到第14天,肿瘤组织内出现大量MDSC的聚集,并可见Foxp3+Treg,三组肿瘤中3LL/Fas-WT接种肿瘤内MDSC和Treg浸润最为显著。为验证上述结果我们进一步的用Percoll密度梯度离心法分离了接种14天后肿瘤内浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes,TIL）,FACS分析了肿瘤内CD11blowGr1lowdMSC以及CD4+Foxp3+Treg分布,结果发现三组肿瘤组织中,3LL/Fas-WT接种的肿瘤组织内dMSC在TIL中的比例以及Foxp3+Treg占CD4+T细胞中的比例最高。IHC和FACS的结果表明,3LL细胞过表达Fas可促进免疫抑制细胞MDSC和Treg在肿瘤内的聚集。在Fas信号介导的MDSC和Treg的肿瘤内聚集过程中,我们发现MDSC先于Treg出现,那么MDSC是否介导了随后Treg在肿瘤内的浸润呢?我们接种1x1063LL/Fas-WT细胞于小鼠皮下,小鼠腹腔内注射anti-Gr1+抗体（RB6-8C5）清除MDSC,肿瘤内浸润的Treg显著降低),该结果提示MDSC参与诱导了肿瘤内Treg的形成。Fas介导的信号对MDSC,Treg肿瘤内聚集有促进作用,已知Fas信号介导了多种炎性细胞的趋化,那么Fas信号促MDSC,Treg肿瘤内聚集效应,是否是通过增强肿瘤细胞对MDSC,Treg的趋化迁移而实现的呢?于是我们体外Jo2刺激3LL细胞,趋化小失迁移实验观察了Jo2处理后上清对MDSC,Treg的趋化迁移的影响,结果显示Jo2刺激的3LL上清可明显促进MDSC的趋化,但是对Treg没有影响。已有文献报道MCP-1、VEGF在肿瘤趋化MDSC向肿瘤内聚集中起重要作用,于是我们用ELISA方法检测Jo2刺激后3LL上清中MCP-1、VEGF的表达变化,但是Jo2刺激后3LL上清中未发现这些细胞因子表达的改变。我们知道在肿瘤发生进展过程中,炎性因子和免疫抑制因子也参与诱导肿瘤免疫耐受微环境的形成。于是我们又检测了免疫耐受相关的重要炎性和免疫抑制因子IL-1β、PGE2、IL-10、TGF-β等细胞因子的表达,结果发现,Jo2刺激可明显促进3LL表达PGE2。进一步的Western blot法检测PGE2诱导生成相关代谢酶COX2的表达发现,Jo2刺激同样上调COX2的表达。有文献报道PGE2可促进DC、内皮细胞的迁移,于是我们进一步研究了PGE2在Fas促肺癌细胞趋化MDSC效应中的作用,发现COX2选择性抑制剂SC58125可显著抑制Jo2对3LL趋化MDSC迁移的增强效应。PGE2可直接作为趋化因子,也可通过上调趋化因子受体,活化细胞迁移相关信号帮助细胞的趋化迁移。那么PGE2究竟是通过什么方式参与趋化MDSC?我们发现,直接用PGE2（1μM）无法有效趋化MDSC,而将PGE2加入3LL细胞培养上清可促进趋化MDSC,该结果提示PGE2可能主要通过协同的方式促进MDSC的趋化迁移。RT-PCR检测介导PGE2细胞迁移的相关EP2、EP4受体表达,发现EP2/EP4在MDSC中高表达,同时3LL细胞中也可见表达。在Fas信号介导的细胞增殖、组织再生、炎症反应中,Fas信号激活伴有下游MAPK,NF-ΚB的活化。于是我们检测了Jo2刺激3LL细胞后这些信号通路的活化情况。Western blot结果发现,Jo2刺激可磷酸化ERK、p38、促进NF-ΚBp65,Stat3的核转位。为进一步研究这些信号通路活化与PGE2生成的关系,我们用这些信号分子特异性的抑制剂阻断这些分子介导的信号通路,发现p38选择性抑制剂SB203580可有效阻断Jo2诱导的PGE2,提示p38信号通路的激活介导了Jo2诱导的PGE2产生。综上所述,在本课题研究中我们首次报道了肺癌细胞3LL内Fas信号可激活下游MAPK,NF-κB下游信号通路,通过p38通路依赖的方式诱导促进3LL肺癌细胞释放PGE2,进而诱导MDSC、Treg肿瘤组织内聚集,从而促进肺癌生长的新机制。该研究结果为肿瘤免疫逃逸研究提供新的机制,同时为阻断PGE2/COX2的肿瘤免疫治疗提供了新的理论依据。
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标签：信号论文; 髓系来源抑制性细胞论文; 调节性细胞论文; 前列腺素论文; 肿瘤免疫逃逸论文;