儿童AML中组蛋白去乙酰化酶与阿糖胞苷活性关系的研究

论文摘要

急性髓系白血病病例（acute myeloid leukemia, AML）占儿童急性白血病的25%,但其死亡病例却占儿童急性白血病死亡病例的50%以上。目前认为导致此疾病治疗失败的主要原因是AML对于以阿糖胞苷（1-β-D-arabinofuranosylcytosine, ara-C）为骨架的化疗产生了抗药性。因此,急需新的治疗方案来提高儿童AML的治愈率。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACI）是近十几年来开发的一类有很好潜能的抗肿瘤新药,包括I类HDAC特异性抑制剂（如MS-275和MGCD0103）和HDAC广谱抑制剂（如LBH-589和PXD101）。体内外研究表明HDACI能促进癌细胞分化,阻断细胞周期和诱导癌细胞凋亡,从而对多种肿瘤产生杀伤作用,但对正常细胞却没有或只有很少的影响。目前大部分HDACI已处于临床试验阶段。然而,此类药物作为单药治疗癌症的临床活性并不强。因此,为HDACI设计具有科学依据的合理的联合用药方案势在必行。在之前的研究中,我们通过对4个儿童AML细胞系和9个原位AML临床诊断样本的细胞毒性分析,发现在所有检测的样本中特别是含t（8；21）染色体异位的,HDACI丙戊酸（valproic acid, VPA）联合阿糖胞苷产生很强的协同抗白血病活性。机理研究显示,这两个药物能协作诱导DNA双链断裂（double-strand breaks,DSB）,并且VPA还能通过诱导Bim蛋白增强两种药物的抗白血病活性。这表明HDAC是非常有潜力的儿童AML的治疗靶点。HDAC家族共有18个成员,各个成员功能也不尽相同。因此,找到与阿糖胞苷活性紧密相关的HDAC家族成员,并据此选出最优的HDACI与阿糖胞苷联用治疗AML患儿以达到最大疗效具有重要意义。首先,我们用免疫印迹法检测HDAC1-11蛋白在4种儿童AML细胞系（THP-1、Kasumi-、MV4-11和CMS）中的表达情况,结果显示HDAC5和11只有微量表达或者未检测到表达,我们推测这两种HDAC应与阿糖胞苷敏感性无关。通过应用不同的HDAC抑制剂（广谱抑制剂SAHA、抑制Ⅰ类Ⅱa类HDAC的VPA和Ⅰ类HDAC特异性抑制剂MS-275）处理THP-1细胞,用免疫沉淀方法获得相应的HDAC蛋白并检测酶活力,我们发现特异性和广谱HDACI均能增强阿糖胞苷诱导的儿童AML细胞凋亡,说明I类和II类的HDAC均可能发挥作用。shRNA慢病毒感染THP-1细胞并沉默不同的HDAC基因的实验结果表明沉默HDAC1或HDAC6显著增强阿糖胞苷诱导的细胞凋亡（近2倍,p<0.05）,并分别伴随2.3和1.4倍的Bim表达增加。沉默HDAC2导致阿糖胞苷诱导的细胞凋亡减少了约30%。但是沉默HDAC3和HDAC4对阿糖胞苷诱导的细胞凋亡没有影响。在临床可达到的剂量下,同时抑制HDAC1和HDAC6的抑制剂有最强的抗白血病活性,并且能显著增强阿糖胞苷诱导的细胞凋亡。用基因芯片筛查HDAC1和HDAC6分别沉默后基因表达的变化,发现HDAC1沉默模型中胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1, IGF-1）转录水平下降。据文献报道,IGF-1能下调Bim的表达,因此我们推测HDAC1活性抑制后通过下调IGF-1的表达使Bim表达水平升高进而促进阿糖胞苷的活性；在HDAC6沉默模型中,HDAC6表达水平的下降伴随着胞苷脱氨酶表达的下降,胞苷脱氨酶能使阿糖胞苷失活,因此抑制HDAC6导致胞苷脱氨酶表达下降,进而增强阿糖胞苷的活性。总之,我们的结果进一步证明了HDAC是潜在的儿童AML药物治疗靶点,并且鉴别出HDAC1和HDAC6是最相关的药物靶点。因此,用广谱的HDAC抑制剂治疗AML患儿可能比特异性HDAC抑制剂更有效。基于以上研究结果,我们强烈建议进行广谱HDAC抑制剂（如LBH-589和PXD101）和阿糖胞苷联用治疗儿童AML的临床实验以提高其治愈率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 白血病
• 1.1.1 白血病的定义、分类和流行病学调查
• 1.1.2 儿童AML的常规治疗方案与治疗瓶颈
• 1.1.3 新辅助药物
• 1.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
• 1.2.1 组蛋白去乙酰化酶的分类及作用机理
• 1.2.2 HDACI的结构、分类与选择性
• 1.2.3 HDACI在癌症治疗领域的研究进展
• 1.3 论文背景和设计思路
• 第二章 组蛋白去乙酰化酶亚型与AML细胞对阿糖胞苷敏感性关系的研究
• 2.1 研究背景
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 儿童AML细胞株Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDAC的表达谱和对HDACI的敏感性
• 2.3.2 在儿童AML细胞中Ⅰ类HDAC的选择性抑制剂和HDAC广谱抑制剂都能促进阿糖胞苷诱导的细胞凋亡
• 2.3.3 shRNA沉默HDAC1和HDAC6显著促进阿糖胞苷诱导的细胞凋亡
• 2.3.4 同时抑制HDAC1和HDAC6的抑制剂具有更强的抗白血病活性
• 2.3.5 DNA损伤和Bim是在儿童AML细胞中HDACI诱导细胞凋亡的关键因素
• 2.3.6 在儿童AML细胞内同时抑制HDAC1和HDAC6能更有效地增强阿糖胞苷诱导的细胞凋亡
• 2.3.7 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 通过基因芯片筛查组蛋白去乙酰化酶与阿糖胞苷活性相关的基因转录变化
• 3.1 研究背景
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 HDAC1沉默模型的基因芯片结果分析
• 3.3.2 HDAC6沉默模型的基因芯片结果分析
• 3.4 小结
• 3.5 作展望
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢