Fn在硅烷化无机材料表面固定及定量表征方法研究

论文摘要

将蛋白质等生物大分子固定在无机生物材料表面,能够在不影响这些材料优良的本体性能的基础上,大幅度提高其生物相容性。然而,目前还没有专门的方法对固定于无机材料表面的蛋白质进行定量检测。本文分别研究了纤连蛋白（Fn）分子在氧化钛表面的固定、Fn分子与CD34抗体在纯钛表面的固定、牛血清白蛋白（BSA）、Fn和层黏连蛋白（Ln）分子在Ca-Na玻璃表面的固定以及Fn分子在石英玻璃表面的固定。并应用水接触角、傅立叶变换红外光谱、X光电子能谱和原子力显微镜等对这些蛋白分子的固定过程进行了检测和分析。使用MicroBCA蛋白定量方法,对这些蛋白的固定进行了量化研究,并且分析了该蛋白定量方法在不同材料表面上的应用,以期探索出一种能够广泛适用于材料表面固定化蛋白定量检测的有效手段,以指导无机生物材料表面生物化修饰的研究。（1）通过磷酸化学吸附,氧化钛薄膜表面获得了大量羟基。在此基础上,进行钛氧薄膜表面硅烷化以引入了氨基,最后,在EDC/NHS体系催化下,将Fn分子共价固定于氧化钛表面。傅立叶变换红外光谱结果和水接触角分析显示蛋白分子固定成功。（2）氧化钛薄膜导致MicroBCA蛋白定量检测呈假阳性。排除光催化导致氧化钛产生自由基的干扰后,假阳性数值仅降低15.3%。MicroBCA试剂假阳性产生的机制有待进一步探索。（3）在纯钛表面,以层层自组装方法固定在外层的蛋白,能够通过MicroBCA方法进行定量检测；但是仅在固定量较大情况下适用于以APTE偶联方法获得的固定化蛋白分子定量。（4）在Ca-Na玻璃表面,通过APTE偶联分别共价接枝BSA、Fn和Ln,其接枝面密度分别为0.22μg/cm2, 0.907μg/cm2和0.38μg/cm2。（5）在一定范围内,随孵化液浓度增加,硅烷化表面固定的Fn量也增大。孵化液的浓度在25～75μg/mL之间变化时,这个效应最为显著。当孵化液浓度高于75μg/mL时,硅烷化表面蛋白固定量接近3μg/cm2,且不再随孵化液浓度增加而显著增多。综上,本文为无机生物材料表面改性与修饰研究中生物大分子的量化表征提供了一种新方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 血液接触性生物材料
• 1.1.1 生物材料的概念及分类
• 1.1.2 生物材料的血液相容性
• 1.1.3 心血管材料的表面改性
• 1.2 生物材料表面生物化改性
• 1.2.1 内皮细胞
• 1.2.2 细胞外基质（ECM）
• 1.2.3 ECM成分蛋白促进内皮化的作用
• 1.2.4 ECM成分蛋白在生物材料表面的固定
• 1.3 蛋白修饰生物材料的定性表征
• 1.4 无机生物材料表面固定化蛋白的定量表征
• 1.4.1 固定化蛋白定量表征的意义
• 1.4.2 固定化蛋白的定量表征方法
• 1.5 本论文研究目的、意义及研究内容
• 1.5.1 课题意义与研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 1.6 本论文的技术路线
• 第2章 实验原理与方法
• 2.1 蛋白质分子的固定原理与方法
• 2.1.1 氧化钛薄膜表面蛋白分子的固定
• 2.1.2 纯钛表面蛋白分子的固定
• 2.1.3 玻璃和石英玻璃蛋白分子的固定
• 2.2 材料表面定性表征方法及原理
• 2.2.1 水接触角
• 2.2.2 傅立叶变换红外图谱（FTIR）
• 2.2.3 原子力显微镜（AFM）
• 2.2.4 X射线光电子能谱分析（XPS）
• 2.2.5 连续波长酶标仪
• 2.3 固定化蛋白质的定量表征（MicroBCA）
• 2.3.1 MicroBCA方法的原理和实验步骤
• 2.3.2 MicroBCA定量检测固定化蛋白的可行性
• 2.3.3 MicroBCA定量检测固定化蛋白的实验步骤
• 2.4 本章小结
• 第3章 Ti-O薄膜表面Fn的固定及定量表征
• 3.1 氧化钛薄膜的制备
• 3.1.1 非平衡磁控溅射原理
• 3.1.2 氧化钛薄膜的制备工艺
• 3.2 氧化钛薄膜的活化
• 3.2.1 氧化钛表面的羟基化
• 3.2.2 硅烷化
• 3.3 氧化钛薄膜表面Fn分子的固定
• 3.3.1 实验仪器及试剂
• 3.3.2 实验步骤
• 3.4 定性表征与结果分析
• 3.4.1 傅立叶红外光谱
• 3.4.2 水接触角
• 3.5 氧化钛表面蛋白定量检测与方法分析
• 3.5.1 蛋白定量检测结果
• 3.5.2 蛋白定量检测方法的分析
• 3.6 MicroBCA试剂的影响因素分析
• 3.6.1 不同基底氧化钛假阳性比较
• 3.6.2 氧化钛薄膜对试剂的影响
• 3.7 本章小结
• 第4章 纯钛表面蛋白的固定及定量表征
• 34抗体'>4.1 层层自组装方法固定CD₃₄抗体
• 34抗体'>4.1.1 内皮祖细胞和CD₃₄抗体
• 4.1.2 实验所用试剂和仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.4 蛋白定量结果与分析
• 4.2 硅烷偶联方法共价固定纤连蛋白
• 4.2.1 实验原理
• 4.2.2 仪器和试剂
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.4 定性结果与讨论
• 4.2.5 蛋白定量结果与讨论
• 4.3 本章小结
• 第5章 玻璃表面固定化蛋白质的量化研究
• 5.1 实验材料及所用仪器和试剂
• 5.2 Ca-Na玻璃表面蛋白固定和表征
• 5.2.1 实验方法
• 5.2.2 定性检测结果与讨论
• 5.2.3 蛋白定量结果与分析
• 5.3 石英玻璃表面蛋白固定和表征
• 5.3.1 实验方法
• 5.3.2 定性检测结果与讨论
• 5.3.3 氨基定量和固定化蛋白定量结果
• 5.4 本章小结
• 第6章 固定化蛋白定量检测综合分析
• 6.1 不同材料对MicroBCA试剂造成的影响
• 6.2 检测结果假阳性产生因素
• 6.2.1 氧化钛产生的自由基
• 6.2.2 表面修饰层的覆盖
• 6.2.3 反应条件环境
• 6.3 MicroBCA方法的应用价值与局限
• 6.4 本章小结
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表论文
• 参与科研项目