IL-6和STAT-3在胃癌中表达关系及双膦酸盐药物抑癌机制的研究

论文摘要

目的:在我国,胃癌是严重威胁人们健康的疾病。在肿瘤细胞增殖、浸润或转移过程中,肿瘤抗原刺激免疫细胞产生和分泌较多的内源性IL-6（interleukin-6,IL-6）,IL-6在肿瘤细胞中的过量表达又可以促进多种细胞的增殖和分化,即内源性的IL-6水平升高与肿瘤的发生、发展密切相关。IL-6的信号主要通过JAK/STATs途径与P21ras/MARK/NF-IL6途径转导至核内。在JAK/STATs途径中,IL-6主要激活信号传导与转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT-3）,STAT-3与多种肿瘤的发生、发展密切相关。多项研究表明,STAT-3通过磷酸化激活后,可导致细胞的异常增殖和凋亡障碍,促进肿瘤的形成和发展。IL-6信号的传导是通过JAK激酶的介导作用使STAT-3发生酪氨酸磷酸化反应而活化[6]。从而形成STAT-3/3同二聚体而转入细胞核,与II型IL-6反应成分（IL-6reactive elemen,tIL-6RE）结合并诱导某些反应基因的表达。因此,在人胃癌细胞株中进行有关IL-6与p-STAT-3信号传导功能关系的研究,有助于阐明JAK/STAT信号途径在胃癌发病机制中所起的重要作用。双膦酸盐类药物（Bisphosphonates,BPs）是用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的一类新药物,最近有研究发现BPs能抑制多种癌细胞系的生长,主要通过抑制羟戊酸旁路的关键酶——焦磷酸法尼酯合酶,减少蛋白质异戊烯化及胞内的信号蛋白的激活,同时抑制肿瘤细胞增殖。为探讨IL-6、STAT-3与胃癌发生的关系及BPs的作用机制,本研究采用免疫组织化学,Western blot方法分别检测了42例临床手术切除胃癌及相应对照组织IL-6、p-STAT-3蛋白表达。同时采用流式细胞术、免疫细胞化学染色、Western blot等方法研究分析,双磷酸盐类药物对体外培养的人胃癌细胞株IL-6、p-STAT-3蛋白表达的影响。为进一步探讨BPs的抗肿瘤作用机制及指导临床用药治疗提供实验依据。材料与方法:1材料1.1收集河北医科大学第二医院胃肠外科2006年1月-2007年12月42例手术切除新鲜胃癌组织及相应远残端黏膜部位胃组织（距肿瘤>10cm）作为对照,所有癌组织均经病理医师确定诊断证实,术前均未接受放疗或化疗。1.2人胃癌细胞株SGC-7901。1.3双膦酸盐类药物（BPs）:IB（伊班膦酸钠）;代号:Cp化合物（含氮磷键的双膦酸化合物,化学名称为[2-（6-氨基-嘌呤-9-基）-1-羟基-膦酰乙基]膦酸,后均简称Cp）。2方法2.1应用免疫组织化学技术（SP法）检测胃癌及对照组织中IL-6、p-STAT-3蛋白的表达。2.2分别提取胃癌及对照组织总蛋白采用蛋白印迹法（Western blot）检测胃癌及对照组织IL-6、p-STAT-3蛋白表达。2.3甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定各组SGC-7901细胞株的增殖情况,以确定半数抑制浓度(IC50)。设立空白对照组、溶剂对照组、药物实验组;药物浓度: IB: 90、120、150、180、210μmol/L; CP: 90、120、150、180、210μmol/L。分别于药物作用72 h后测定IOD值,计算细胞生长抑制率,根据IC50=Lg-1（ Xm﹣I（∑p﹣0.5））,确定IC50 （IB:220μmol/L, CP :150μmol/L）。2.4两种药物以IC50浓度分别作用细胞72h后收集细胞。流式细胞定量检测技术（FCM）检测细胞凋亡率的变化。2.5分别选取两种药物的三个不同浓度,IB: 160μmol/L、220μmol/L、280μmol/L; CP: 90μmol/L、150μmol/L、210μmol/L作用于SGC-7901细胞株,FCM检测药物作用24h、48h、72h后细胞周期的变化。2.6蛋白免疫印迹（Western Blot）检测两种药物以IC50浓度分别作用24h、48h、72 h,细胞中IL-6,p-STAT-3蛋白的表达情况。2.7免疫细胞化学法（SP法）观察药物作用72 h细胞IL-6、p-STAT-3蛋白表达情况的变化。结果:1免疫组织化学结果IL-6主要为胞浆着棕黄色,p-STAT-3胞浆和胞核均着棕黄色。在42例对照组织中IL-6阳性表达率为9.62%（3/42）,p-STAT-3未见表达。在42例胃癌组织中IL-6和p-STAT-3表达的阳性率为73.81%（31/42）和35.71%（15/42）明显高于对照组织（P<0.05）。IL-6,p-STAT-3两种蛋白表达水平之间呈显著正相关关系（X2=10.227 P<0.05）,癌组织中IL-6蛋白表达分别与淋巴结转移、浸润深度有显著相关性（P<0.05）,在淋巴结转移或侵入浆膜的胃癌组织中,IL-6的表达阳性率明显增高;而与患者性别、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度无相关性（P>0.05）;p-STAT-3蛋白表达分别与淋巴结转移、肿瘤分化程度有显著相关性（P<0.05）,在淋巴结转移或分化程度低的胃癌组织中p-STAT-3蛋白表达阳性率明显增高,而与患者性别、肿瘤组织学类型、浸润深度无相关性（P>0.05）。2 Western Blot检测结果β-actin、IL-6、p-STAT3蛋白分子量为42KD、26kD、90kD,Western杂交后在相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析,蛋白含量以积分光密度值（IOD）表示。每次检测蛋白时均以β-actin蛋白为内参,以相对积分光密度比较蛋白表达高低。与对照组织相比,42例有33例出现胃癌组织中IL-6蛋白高表达,其高表达率为78.57%,有27例出现p-STAT3蛋白高表达,其高表达率为64.28%。3 IB、CP对SGC-7901细胞株增殖的影响两种药物均可抑制SGC-7901细胞增殖,药物浓度和作用时间不同其抑制作用不同。随着药物浓度增加,作用时间延长,抑制作用逐渐增强,210μmol/L的CP和IB作用72 h的抑制率分别达76.43%、51.71%。溶剂对照组与空白对照组细胞未见明显变化.（P>0.05）。IB的IC50为220μmol/L,CP的IC50为150μmol/L。4流式细胞术检测结果两种药物均可诱导SGC-7901细胞株凋亡,药物实验组SGC-7901细胞DNA直方图二倍体峰前均可见凋亡细胞特征性的亚二倍体峰（Fig.1-3）,对照组未见凋亡峰。IB组与CP组凋亡率均高于对照组（P<0.05）,提示BPs可促进胃癌细胞株凋亡,两种药物组之间细胞的凋亡率无显著差异（P>0.05）。两种药物对于细胞周期的影响均显著大于对照组（P<0.05）,随着药物作用时间的延长,药物浓度的增加,S期细胞数逐渐增加,G0/G1期和G2/M期细胞数逐渐减少。CP组作用强于IB组（P<0.05,Table 3）。由此可见,BPs可以将细胞阻滞于S期,且有明显的量效和时效关系。5免疫细胞化学结果光镜下观察IB、CP作用于SGC-7901细胞72h后, IL-6、p-STAT-3蛋白表达与对照组比较均降低。CP作用强于IB。6 Western Blot检测结果随着BPs作用时间延长IL-6,p-STAT-3蛋白表达量逐渐降低,药物作用时间与表达量呈负相关（r=-0.627,r=-0.738,P<0.05）。CP组作用强于IB组,两者与对照组比较,均有显著性差异（P<0.05）。结论:1在胃癌组织中IL-6、p-STAT-3呈现高表达,两者之间有显著正相关关系,在淋巴结转移或侵入浆膜的胃癌组织中,IL-6蛋白表达阳性率明显增高;在淋巴结转移或分化程度低的胃癌组织中p-STAT-3蛋白表达阳性率明显增高。2双膦酸盐类药物抗肿瘤作用机制为通过调节IL-6使STAT-3蛋白活化受抑制,降低磷酸化STAT-3蛋白表达,从而减低p-STAT-3细胞的促进增殖和抑制凋亡的作用,进而抑制肿瘤。3双膦酸盐类药物可诱导肿瘤细胞凋亡,还可通过延长细胞周期,抑制肿瘤细胞的增殖。4 IB与CP比较,CP对人胃癌细胞株SGC8901细胞周期的影响和降低细胞中IL-6、p-STAT-3蛋白表达的作用均明显强于IB。

论文目录

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• 研究论文 IL-6 和STAT-3 在胃癌中表达关系及双膦酸盐药物抑癌机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 细胞因子IL-6 蛋白和转录因子STAT-3 在胃癌细胞株中表达的相关性研究及双膦酸盐的抑癌机制
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