论文摘要
目的:依据“性味—功效”相关性理论和医家的临证思维方法,从性味配伍对银翘散进行拆方研究。通过银翘散及其性味分组提取物抗IV感染MDCK细胞、小鼠实验,从抑制IV、诱生干扰素、抑制细胞凋亡等角度来探讨银翘散抗IV主要作用机制、主要生物效应和方中药物的最佳剂量配比关系,为银翘散多层次、多环节、多靶点抗IV作用提供理论支持和实验依据。材料与方法:1.采用乙醇提取方法制备银翘散及其性味分组提取物。2.用IV滴鼻造成小鼠感染模型,以小鼠肺组织中病毒的血凝滴度作为观察指标,运用正交设计方法,观察银翘散各药物配伍与药效之间的关系。3.建立IV感染细胞模型,通过先感染病毒后给药、先给药后感染病毒和药物病毒同时作用三种给药方式,采用CPE和MTT法观察银翘散及其性味分组提取物对IV感染MDCK细胞的作用。4.采用DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL法检测细胞凋亡;通过细胞爬片,采用免疫组化法检测凋亡细胞Fas/FasL的表达,观察银翘散及其性味分组提取物对IV感染MDCK细胞诱导细胞凋亡的影响。5.建立小鼠IV肺炎模型,应用RT-PCR和ELISA法检测IV感染量及IFN-γ的含量,结合小鼠一般状态、肺组织病理切片、形态学、肺指数等指标,观察银翘散及其性味分组提取物对IV感染小鼠的作用。6.采用TUNEL法和免疫组化法观察小鼠肺组织细胞凋亡及Fas/FasL的表达,观察银翘散及其性味分组提取物对IV感染小鼠诱导细胞凋亡的作用。结果:1.通过直观分析和正交分析,银翘散必要因素有连翘、金银花、牛蒡子、荆芥穗、竹叶、生甘草、桔梗、薄荷（P<0.05）,而淡豆豉的作用不明显（P>0.05）。2.银翘散及其性味分组对IV感染具有不同程度的治疗作用,银翘散组作用与药物浓度呈正向关。银翘散（1:1～1:4）及清热解毒（1:1～1:2）组治疗效果与病毒唑组比较无显著性差异（P>0.05）。银翘散及其性味分组对IV具有较好的预防作用,银翘散（1:1～1:8）、清热解毒（1:1～1:8）、辛凉解表（1:1～1:4）、辛温解表（1:1～1:8）组与病毒唑组比较有显著差异（P﹤0.05）,银翘散、清热解毒、辛温解表组作用与药物浓度呈正向关。银翘散及其性味分组对IV具有直接灭杀作用（P﹤0.05）,其中银翘散、清热解毒组作用与药物浓度呈正向关。银翘散（1:1～1:2）、清热解毒（1:1～1:4）、辛凉解表（1:1）组直接灭杀IV作用优于病毒唑组（P﹤0.05）,而辛温解表组与病毒唑组比较无显著差异（P﹥0.05）。3.银翘散及其性味分组和病毒唑组未出现凋亡“梯状”图谱,能降低凋亡指数（AI）,减少细胞凋亡,增强Fas的吸光度（P﹤0.05）。与病毒唑组相比,银翘散、清热解毒组无显著性差异（P﹥0.05）,而辛凉解表、辛温解表组有显著性差异（P﹤0.05）。与病毒组相比,银翘散、清热解毒、辛凉解表组和病毒唑组能升高FasL的吸光度,有显著性差异（P﹤0.05）;与病毒唑组相比,银翘散、清热解毒组无显著性差异（P﹥0.05）,而辛凉解表组有显著性差异（P﹤0.05）。4.小鼠IV肺炎模型复制:肺组织中检测到IV总RNA大量表达,肺指数增高,病理改变呈间质性肺炎病变:肺泡间隔水肿、炎细胞浸润,肺泡腔内浆液性渗出。5.小鼠肺组织IV总RNA的表达:与病毒组比较,银翘散及其性味分组和病毒唑组均有显著差异（P﹤0.05）,与病毒唑组比较,银翘散、清热解毒、辛凉解表组无显著差异（P﹥0.05）,辛温解表组有显著差异（P﹤0.05）。6.RT-PCR法测IFN-γ表达:与病毒组比较,银翘散、清热解毒、辛温解表组及病毒唑组有显著差异（P﹤0.05）,辛凉解表组无显著差异（P﹥0.05）;与病毒唑组比较,银翘散、清热解毒、辛凉解表组有显著差异（P﹤0.05）,辛温解表组无显著差异（P﹥0.05）。ELISA法:IV感染小鼠,其肺组织中的IFN-γ含量明显增多（P﹤0.05）;与病毒组比较,银翘散、清热解毒组及病毒唑组有显著差异（P﹤0.05）,辛凉解表、辛温解表组无显著差异（P﹥0.05）;与病毒唑组比较,银翘散及其性味分组均有显著差异（P﹤0.05）。7.IV感染能够诱导小鼠肺组织细胞凋亡,Fas及FasL蛋白大量表达（P<0.05）,银翘散组、清热解毒组能够降低凋亡指数（AI）,抑制IV感染诱导小鼠肺组织的细胞凋亡（P<0.05）,同时能下调肺组织中Fas/FasL蛋白表达（P<0.05）。与病毒唑组FasL相比,银翘散组无显著性差异（P﹥0.05）,清热解毒组有显著性差异（P﹤0.05）。辛凉解表、辛温解表组,与病毒组AI比较,无显著差异（P﹥0.05）;与病毒唑组Fas相比,有显著性差异（P﹤0.05）;与正常组FasL比较,无显著性差异（P﹥0.05）。结论:1.从降低IV滴鼻感染小鼠肺组织匀浆血凝滴度的角度看,银翘散以连翘2金银花2牛蒡子2荆芥穗1竹叶2生甘草2桔梗1薄荷2淡豆豉1治疗效果好。2.银翘散及其性味分组对IV感染MDCK细胞具有预防、治疗和直接灭杀作用。辛温解表组对银翘散直接灭杀IV作用的贡献率不如其它二组。在不同的给药方式中,“先用药后感染病毒”抑制病毒作用效果最好。3. IV感染MDCK细胞能够诱导细胞凋亡。银翘散及其性味分组能够抑制IV诱导MDCK细胞凋亡,其作用机制可能是通过Fas/FasL途径来实现,其中清热解毒组起了主要作用。4.银翘散具有直接抑制IV、减少肺病理损伤和诱生干扰素作用,前二者是清热解毒组、辛凉解表组、辛温解表组三合方“整合”的结果,后者主要是通过清热解毒组而奏效。5.IV感染能够诱导小鼠肺组织发生细胞凋亡。银翘散能够抑制IV诱导小鼠肺组织细胞凋亡,可能是通过Fas/FasL途径来实现,其中清热解毒组起了主要作用。