论文摘要
在豆科植物中，结瘤因子作为根瘤菌共生信号分子作用于寄主植物，植物中的结瘤因子受体NFR1和NFR5共同参与接受结瘤因子信号，并与之相结合，然后依次将结瘤因子信号传递到下游调控结瘤基因，从而引起植物细胞一系列形态、生理及生化变化。同时也完成了寄主植物与根瘤菌早期分子对话和信号传递。本研究希望能在豆科植物百脉根中发现与豆科植物结瘤因子受体NFR5相互作用的蛋白质，从而进一步揭示NFR5的功能以及根瘤菌与植物共生固氮的信号途径。本研究包括两部分内容，主要内容如下：1)用酵母双杂交技术筛选与结瘤因子受体NFR5相互作用的蛋白以豆科植物百脉根的mRNA为模板，通过RT-PCR，扩增到1.0kb结瘤因子受体5（nod factor receptor NFR5）蛋白激酶结构域的DNA片段（nfr5-pk），并将该片段克隆到酵母双杂交BD载体pGBKT7上。通过酵母双杂技术，筛选接种根瘤菌的百脉根AD-cDNA酵母双杂交文库。结果从文库中分离到与nfr5-pk相互作用的221个阳性克隆，经从这些阳性克隆酵母中分离AD质粒反复验证后，对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析。通过NCBI数据库比对分析鉴定出小G蛋白ROP6等六个与NFR5-PK相互作用的不同基因，其结果为进一步研究NFR5基因的功能和调控机制提供材料。2)百脉根小G蛋白ROP6与根瘤菌结瘤因子识别和信号传导相关性的鉴定和分析以酵母双杂交筛选得到的pGADT7-ROP6质粒为模板，构建pTYB12-ROP6重组载体；将重组表达载体pTYB12-ROP6转化到E．coli．ER2566菌株中，利用原核表达系统表达CBD-ROP6融合蛋白，用Chintin beads进行纯化，待用于体外验证实验。小G蛋白ROP6能与NFR5相互作用，说明它可能参与结瘤因子信号转导。分别收集接种根瘤菌后第2，4，6，8天百脉根的根，同时收集未接种根瘤菌百脉根的根，分别抽提的总RNA为模板，进行RT-PCR分析。结果说明，ROP6在未接种根瘤菌的植株中表达量很低，在接种根瘤菌的植株中，其表达量随接种时间的增加而增加。说明小G蛋白ROP6的表达依赖于根瘤菌的诱导。