血管内皮生长因子在胚胎成骨细胞中的表达研究及应用

论文摘要

目的:对含有血管内皮生长因子VEGF基因片段的胚胎成骨细胞进行细胞培养体外扩增,观察转染后的成骨细胞的增殖功能、及生物学特性变化,再以含有目的基因的成骨细胞为种子细胞,在选定的可吸收材料生物支架的基础上通过生物膜塑形成预先设定的三维立体形状,将体外培养的软骨细胞种植于其表面使其相容,构建特定形状的血管化的复合组织工程人工骨,以期实现从分子水平对骨缺损、骨坏死、骨不连等的治疗,为临床治疗骨坏死等医学界棘手问题提供一种崭新的理论基础和治疗方法。现在临床工作中各种原因引起的骨坏死病例日渐增多,且有种类较多,逐渐趋于年轻化、复杂化的趋势。目前临床上常用的治疗骨坏死的方法有:死骨摘除假体填塞,假体置换,带蒂骨瓣移植,中药保守治疗等等,这些疗法往往损伤较大但效果却不甚理想,病人的运动和感觉功能恢复常令人不甚满意。甚至有可能造成终身病废。因此本课题设计志在通过使用现代分子生物学技术,以VEGF基因片段（ad5-h-VEGF）为目的基因,结合人的5型腺病毒,构件含有目的基因的腺病毒载体,将刚出生的胎鼠（SD大鼠）胚胎成骨细胞进行体外培养扩增,当细胞增殖到对数增长期时,以此期的细胞为靶细胞进行体外转染,使转染的成骨细胞既保持其自身的增殖能力,又通过其表达的VEGF促进血管再生,这样既解决了骨质再生问题又解决了缺乏血运的难题。而且经实验研究已经证实VEGF还有促进骨化的作用。通过免疫组化和免疫荧光、细胞流式方法等检测其表达,通过细胞增殖实验（描绘其转染前后的生长曲线）等了解目的基因转染后成骨细胞其生物学活性及增殖功能变化,靶细胞基因修饰表达成功以后移植体内,观察移植物血管化进程和转染成骨细胞的增殖功能,为以后种植在具有良好组织相容性及可降解性的生物支架以及生物膜塑形,外覆体外培养的软骨细胞构建血管化的组织工程骨,通过对比观察骨缺损实验动物模型的内环境及各种应力的作用下的组织工程骨的生物学情况,期望得出该方法是治疗临床各种骨坏死的可行的有效的理想的仿生学治疗方法。为临床治疗骨坏死提供一种新的突破性的治疗方法与理念。方法:胎鼠颅盖骨取成骨细胞作原代培养,将成骨细胞置于37℃,饱和湿度5%CO2的常规条件下培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1细胞培养:取刚产下的SD大鼠的胎鼠,放入75%的酒精中浸泡5分钟。四肢固定于蜡盘上。切开颅定皮肤暴露并取下颅盖骨,尽量剔除干净残存的骨膜及软组织,Hanks液浸泡冲洗,使用胰酶及Ⅱ型胶原酶双酶消化法消化30min,消化处理后的颅盖骨,Hanks液浸泡冲洗,将消化后的颅盖骨在瓶皿中剪成约1mm3的组织块,在DMEM中贴壁培养,每日再倒置显微镜下观察细胞生长情况。2成骨细胞鉴定及检测技术,包括形态学观察（成骨细胞扫描电镜观察）,吉姆萨染色法,碱性磷酸酶（ALP）,甲苯胺蓝染色法,矿化结节染色（茜素红染色）等方法鉴别。3构建含有VEGF基因片段（ad5-h-VEGF）的人5型腺捕驹靥?将胚胎成骨细胞进行体外培养扩增传代,以进入对数生长期的成骨细胞为靶细胞进行转染,测绘转染前后各自生长曲线。免疫组化染色及免疫荧光定性分析转染后目的基因在靶细胞中的表达情况。并通过流式细胞技术定量检测成骨细胞中的目的基因转染率。结果:1成骨细胞的培养及观察培养的原代成骨细胞约5—7天爬满培养瓶,倒置显微镜下观察生长期贴壁后的成骨细胞多呈梭形或三角形或多角形,圆形或椭圆形的细胞核居中或偏于细胞一侧,有较多突起,单核或1-3个核仁,胞质丰富、清晰。生长期细胞分裂相多见,细胞突起相互联接。细胞表面有数量不等、长短不一的突起伸出,细胞呈集落化生长趋势可复层生长,形成细胞结节甚至团块状。2扫描电镜下可见成骨细胞有多个突起,表面较多突起,形态饱满。细胞间由突起互相联接。3碱性磷酸酶（ALP）染色（Gomori钙钴法）,成骨细胞胞质中呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。4矿化结节染色（茜素红法）后,肉眼见矿化结节呈现不同的红色团块。5 Giemsa染色法,见胞浆丰富染成粉红色,细胞核染成紫蓝色,成圆形或卵圆形,位于细胞中央或偏向一侧,核仁明显。6 VEGF转染前、后细胞生长曲线对照:转染后成骨细胞的增殖较未转染的同代空白对照组,在不同的时间段均有增殖增强的趋势,且一定生长时限后生长均趋于平缓。7成骨细胞目的基因转染后免疫组化染色苏木精复染后定性分析:以不同感染复数的Ad5-h-VEGF感染成骨细胞,培养72小时后,对照组细胞细胞即转染（-）组,细胞核呈红色,胞浆不显色。实验组即转染（+）组,转染细胞细胞核呈红色,胞浆呈土红色或棕色。如果没有苏木精复染细胞核均不显色,只是转染阳性者胞浆显色土红色或棕色。8成骨细胞目的基因转染后免疫荧光染色PE复染后定性分析:以不同感染复数的Ad5-h-VEGF感染成骨细胞,培养72小时后,对照组细胞细胞即转染（-）组,细胞核呈红色荧光,胞浆不显色。实验组即转染（+）组,转染细胞细胞核呈红色荧光,胞浆呈淡绿色荧光。9以不同感染复数的Ad5-h-VEGF感染成骨细胞,培养72小时后,流式细胞仪检测目的基因转染阳性率,对成骨细胞目的基因转染做定量分析。结论:1通过双酶消化,贴壁培养法可得到较纯的原代成骨细胞。对培养的成骨细胞可以通过形态学及生长特性等的观察进行鉴定,根据成骨细胞的生化特性可采取碱性磷酸酶（ALP）染色（Gomori钙钴法）,矿化结节染色（茜素红法）,吉姆萨染色法等加以印证核实。2携带目的基因-VEGF基因的腺病毒载体即ad5-h-VEGF,可以成功转染成骨细胞,且转染效率在一定程度上呈现滴度时间依赖趋势,转染的最佳MOI（感染复数）约为45,最佳时间约为转染后48—72小时。3 ad5-h-VEGF载体能够成功转染成骨细胞,且VEGF能够在成骨细胞中成功表达,VEGF在成骨细胞中的表达属胞浆表达。VEGF转染后能够促进成骨细胞生长及成骨。4 VEGF在成骨细胞的表达可通过免疫组化、免疫荧光定性检测,通过细胞流式进行定量检测。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 血管内皮生长因子在胚胎成骨细胞中的表达研究及应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 组织工程骨的研究与应展
• 致谢
• 个人简历