极端环境微生物三种功能基因的克隆与表达

论文摘要

极端环境微生物是各种特殊性质酶的重要来源。为寻找各种新的酶资源,本论文从北方高温堆肥分离的枯草芽孢杆菌FS321中克隆了中度耐热脂肪酶、中度耐热α-淀粉酶基因及从嗜碱芽孢杆菌OF4中克隆了α-葡萄糖苷酶基因,并分别实现在大肠杆菌中的表达。上述结果为进一步对这些酶的分子改造提供了新的基因资源,也为深入研究这些酶基因的结构与功能关系奠定了基础。主要研究内容如下:1、FS321产脂肪酶的最适培养基是M4,发酵周期为48～60h,摇瓶发酵温度为37℃,通气量为25mL/250mL锥形瓶。脂肪酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为9.0。为鉴定该菌株,分析该菌的细胞脂肪酸谱,克隆测序了其16SrDNA序列,系统进化树及细胞脂肪酸组分分析均表明FS321是一株Bacillus subtilis。2、利用PCR扩增获得了FS321脂肪酶基因BSL的完整阅读框,BSL全长639bp。进一步构建表达质粒pET-28a-BSL,以E.coli BL21（DE3）为宿主进行表达。SDS-PAGE检测到大小约27.5kDa的重组融合蛋白,三丁酸甘油酯平板酶活鉴定出现透明圈,表明BSL实现了有效表达。3、用同（2）的方法成功克隆到FS321α-淀粉酶基因（BSA）,BSA全长1980bp。并构建了重组质粒pET-28a-BSA,转化E.coli BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE检测出现大小约76.0kDa的重组融合蛋白,可溶性淀粉平板酶活鉴定结果表明BSA实现了有效表达。重组淀粉酶的最适反应温度为50℃和最适反应pH为7.5。4、根据嗜碱芽孢杆菌OF4基因组部分测序结果,发现其有一条基因对应的氨基酸序列与GenBmak中一些芽孢杆菌的α-1,4-葡萄糖苷酶氨基酸序列相似性达60～76%,初步判断其属于α-1,4-葡萄糖苷酶基因,命名为ABPG.。通过PCR扩增获得该基因,把该基因连接在表达质粒pET-28a（+）上,在E.coli BL21（DE3）中实现了高效表达。利用表达质粒上的His融合标签进行亲和纯化,获得电泳纯融合蛋白,其大小约为68.5 kDa。该酶最适底物为麦芽糖,对其表现的最高比活为164.2U/mg,酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。在pH8.0～pH10.0的缓冲体系中4℃保存12h后,酶的残余酶活为初始酶活的56.4～73.0%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 微生物脂肪酶研究概况
• 1.2.1 微生物脂肪酶性质
• 1.2.2 微生物脂肪酶来源
• 1.2.3 脂肪酶的分子结构
• 1.2.4 微生物脂肪酶的克隆、表达研究进展
• 1.2.5 脂肪酶定向进化研究进展
• 1.2.6 微生物脂肪酶的应用进展
• 1.3 微生物淀粉酶研究概况
• 1.3.1 α-淀粉酶的性质
• 1.3.2 α-淀粉酶作用机理
• 1.3.3 产α-淀粉酶的主要微生物类群
• 1.3.4 α-淀粉酶的结构
• 1.3.5 α-淀粉酶的活力的测定方法
• 1.3.6 耐热α-淀粉酶的应用
• 1.3.7 耐高温α-淀粉酶生产菌株育种进展
• 1.3.8 α-淀粉酶分子生物学研究进展
• 1.4 微生物α-葡萄糖苷酶的研究概况
• 1.4.1 α-葡萄糖苷酶的理化性质
• 1.4.2 α-葡萄糖苷酶活性测定方法
• 1.4.3 α-葡萄糖苷酶的蛋白质结构与活性中心
• 1.4.4 α-葡萄糖苷酶的催化机制
• 1.4.5 α-葡萄糖苷酶的应用及前景展望
• 1.5 本课题主要内容和目的意义
• 1.5.1 本课题主要内容
• 1.5.2 本课题的目的、意义
• 第2章 脂肪酶产生菌B.subtilis FS321的分离鉴定及其产酶条件的初步优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 脂肪酶产生菌发酵条件实验
• 2.3.2 脂肪酶最适反应条件初探试验
• 2.3.3 细菌FS321细胞脂肪酸成分分析
• 2.3.4 细菌FS321核糖体基因16S rDNA克隆与序列分析
• 2.4 小结
• 第3章 B.subtilis FS321的脂肪酶基因的克隆与表达
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 酶和主要试剂
• 3.2.4 引物序列
• 3.2.5 主要溶液及缓冲液的配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 B.subtilis FS321脂肪酶基因的克隆、测序
• 3.3.2 B.subtilis FS321脂肪酶基因的表达
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 B.subtilis FS321脂肪酶基因的获得
• 3.4.2 脂肪酶基因的克隆
• 3.4.3 肪酶基因序列分析
• 3.4.4 肪酶基因的表达
• 3.5 小结
• 第4章 B.subtilis FS321的α-淀粉酶基因的克隆与表达
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 酶和试剂
• 4.2.4 引物序列
• 4.2.5 其它溶液和缓冲液
• 4.3 方法
• 4.3.1 B.Subtilis FS321 α-淀粉酶的最适反应温度试验
• 4.3.2 α-淀粉酶基因的克隆、测序
• 4.3.3 重组α-淀粉酶的表达
• 4.3.4 重组α-淀粉酶酶学性质的初步研究
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 B.subtilis FS321α-淀粉酶最适反应温度试验
• 4.4.2 B.subtilis FS321α-淀粉酶基因的获得
• 4.4.3 α-淀粉酶基因的克隆
• 4.4.4 淀粉酶基因序列分析
• 4.4.5 α-淀粉酶基因的表达
• 4.4.6 α-淀粉酶的酶学性质研究
• 4.5 小结
• 第5章 嗜碱芽孢杆菌OF4的α-葡萄糖苷酶基因克隆与表达
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 菌株与质粒
• 5.2.2 化学试剂与酶
• 5.2.3 引物序列
• 5.2.4 培养基
• 5.3 方法
• 5.3.1 提取专性嗜碱菌OF4的基因组DNA
• 5.3.2 α-葡萄糖苷酶基因序列的获得
• 5.3.3 提取表达质粒pET28a（+）
• 5.3.4 重组α-葡萄糖苷酶菌株的构建
• 5.3.5 重组α-葡萄糖苷酶的表达
• 5.3.6 重组α-葡萄糖苷酶的纯化
• 5.3.7 重组酶蛋白浓度的测定
• 5.3.8 酶活测定和酶学性质初步研究
• 5.4 结果
• 5.4.1 α-葡萄糖苷酶基因序列分析
• 5.4.2 α-葡萄糖苷酶PCR扩增的结果
• 5.4.3 α-葡萄糖苷酶阳性克隆的筛选与验证
• 5.4.4 重组α-葡萄糖苷酶的表达验证
• 5.4.5 酶活测定和酶学性质初步研究
• 5.5 小结
• 总结
• 展望
• 附录
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历