金纳米粒子和碳纳米管对骨髓基质细胞成骨及成脂方向分化的影响

论文摘要

近年来,纳米材料所具有的特殊物理性质,引起了人们的重视,科学家开始把它应用到疾病的防御、诊断和治疗等生物医学领域,特别是医学中的组织重建中。由于自身组织和器官是纳米级的,纳米材料的生物模拟特性和特殊的物理性质使之在进行组织重建时刺激细胞的生长,引导组织修复。尽管这是一个新的领域,但是已有很多科学家设计合成出了生物模拟材料包裹细胞（如干细胞、软骨细胞、骨细胞等）并应用于组织工程。然而,纳米材料的超小粒径使其能通过多种途径进入人体,如骨髓。当纳米粒子进入骨髓后,骨代谢平衡和骨组织功能是否会受到影响还需要我们进行深入的研究。因此,本文以骨髓基质细胞和成骨细胞为模型,采用四甲基偶氮唑蓝法、碱性磷酸酶比活性和油红O染色及定量测定等方法在细胞水平研究了金纳米粒子（Au NPs）和碳纳米管（CNTs）对小鼠骨髓基质细胞增殖、成骨、成脂分化和成骨细胞增殖及横向分化的影响,并用免疫印迹（Western blot）和实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR）等方法对骨髓基质细胞成骨和成脂分化过程中相关重要蛋白和基因进行了研究。研究结果表明：1.细胞水平上金纳米粒子可以促进小鼠骨髓基质细胞、原代骨细胞向成骨方向分化,抑制其向成脂及横向成脂分化；2.细胞水平上碳纳米管可以抑制小鼠骨髓基质细胞、原代骨细胞成骨成脂及横向成脂分化；3.金纳米粒子上调成骨分化相关基因（Runx2、BMP-2、OCN、ALP等）的表达,下调成脂分化相关基因（PPARγ2、E/CBPα、E/CBPβ和E/CBPδ）的表达；4.碳纳米管下调成骨成脂分化相关基因的表达；5.金纳米粒子上调小鼠骨髓基质细胞、原代骨细胞成骨分化过程中Runx2和BMP-2蛋白的表达。综合上述结果,金纳米粒子在促进成骨分化的同时抑制了成脂及成脂横向分化,而碳纳米管抑制了骨髓基质细胞成骨成脂的分化和原代成骨细胞成骨及横向成脂的分化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 纳米材料的分类
• 1.1.1 零维纳米粒子
• 1.1.2 一维纳米纤维
• 1.1.3 二维纳米薄膜
• 1.1.4 三维纳米块体
• 1.2 纳米材料的特性
• 1.2.1 力学性质
• 1.2.2 光学性质
• 1.2.3 电学性质
• 1.2.4 磁学性质
• 1.2.5 热学性质
• 1.3 纳米材料在组织工程中的应用
• 1.3.1 纳米材料在骨和软骨组织工程中的应用
• 1.3.2 纳米材料在动脉组织工程中的应用
• 1.3.3 纳米材料在神经组织工程中的应用
• 1.3.4 纳米材料在膀胱组织工程中的应用
• 1.4 立题依据
• 第2章 金纳米粒子对骨髓基质细胞（MSCs）成骨、成脂分化及其功能的影响
• 2.1 金纳米粒子对MSCs成骨及成脂方向分化的影响
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 实验动物
• 2.1.1.2 实验试剂
• 2.1.1.3 实验仪器
• 2.1.1.4 实验样品
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 原代MSCs的分离培养
• 2.1.2.2 MSCs增殖实验
• 2.1.2.3 碱性磷酸酶（ALP）活性测定
• 2.1.2.4 矿化结节染色及定量
• 2.1.2.5 油红O染色及定量
• 2.1.2.6 统计分析
• 2.1.3 实验结果
• 2.1.3.1 金纳米粒子对MSCs增殖的影响
• 2.1.3.2 金纳米粒子对MSCs成骨分化早期ALP活性的影响
• 2.1.3.3 金纳米粒子对MSCs成骨分化晚期矿化功能的影响
• 2.1.3.4 金纳米粒子对MSCs成脂分化的影响
• 2.2 余纳米粒子对MSCs成骨及成脂分化过程中重要基因表达的影响
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 实验动物
• 2.2.1.2 实验试剂
• 2.2.1.3 实验仪器
• 2.2.1.4 实验样品
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 RNA的提取
• 2.2.2.2 First-strand cDNA合成
• 2.2.2.3 荧光定量聚合酶链反应（Q-PCR）
• 2.2.2.4 cDNA SuperArray Analysis
• 2.2.2.5 统计分析
• 2.2.3 实验结果
• 2.2.3.1 金纳米粒子对MSCs成脂方向分化过程中重要基因表达的影响
• 2.2.3.2 cDNA SuperArray分析金纳米粒子对MSCs成骨分化中基因表达的影响
• 2.2.4 实验结果讨论
• 2.3 金纳米粒子对MSCs成骨成脂分化过程中Runx2、BMP-2和PPAR γ-2蛋白的表达
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.1.1 实验动物
• 2.3.1.2 实验试剂
• 2.3.1.3 实验仪器
• 2.3.1.4 实验样品
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 细胞蛋白的提取
• 2.3.2.2 蛋白定量
• 2.3.2.3 Western Blot实验流程
• 2.3.3 实验结果
• 2.3.3.1 金纳米粒子对MSCs成骨分化中Runx-2和BMP-2蛋白表达的影响
• 2.3.3.2 金纳米粒子对MSCs成脂分化中PPAR γ-2蛋白表达的影响
• 2.3.4 实验结果讨论
• 2.4 金纳米粒子对MSCs成骨分化过程中细胞表面形态及超微结构的影响
• 2.4.1 实验材料
• 2.4.1.1 实验动物
• 2.4.1.2 实验试剂
• 2.4.1.3 实验仪器
• 2.4.1.4 实验样品
• 2.4.2 实验方法
• 2.4.2.1 MSCs的分离培养
• 2.4.2.2 扫描电子显微镜（SEM）观察
• 2.4.2.3 透射电子显微镜（TEM）观察
• 2.4.3 实验结果
• 2.4.3.1 金纳米粒子对MSCs成骨分化过程中表面结构的观察
• 2.4.3.2 金纳米粒子对MSCs成骨分化过程中超微结构的观察
• 2.4.4 实验结果讨论
• 第3章 金纳米粒子对原代骨细胞（OB）增殖、分化及成脂横向分化的影响
• 3.1 金纳米粒子对OB增殖、分户及成脂横向分化的影响
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 实验动物
• 3.1.1.2 实验试剂
• 3.1.1.3 实验仪器
• 3.1.1.4 实验样品
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 OB的分离培养
• 3.1.2.2 OB增殖实验
• 3.1.2.3 碱性磷酸酶（ALP）活性测定
• 3.1.2.4 矿化结节染色及定量测定
• 3.1.2.5 油红O染色及定量测定
• 3.1.2.6 统计分析
• 3.1.3 实验结果
• 3.1.3.1 金纳米粒子对OB增殖的影响
• 3.1.3.2 金纳米粒子对OB成骨分化早期ALP活性的影响
• 3.1.3.3 金纳米粒子对OB成骨分化晚期矿化功能的影响
• 3.1.3.4 金纳米粒子对OB成脂横向分化的影响
• 3.1.4 实验结果讨论
• 3.2 金纳米粒子对OB成骨及成脂横向分化过程中重要基因和蛋白表达的影响
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 实验动物
• 3.2.1.2 实验试剂
• 3.2.1.3 实验仪器
• 3.2.1.4 实验样品
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 RNA的提取
• 3.2.2.2 First-strand cDNA合成
• 3.2.2.3 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 3.2.2.4 细胞蛋白的提取
• 3.2.2.5 蛋白定量
• 3.2.2.6 Western Blot实验流程
• 3.2.2.7 统计分析
• 3.2.3 实验结果
• 3.2.3.1 金纳米粒子对OB成骨及横向成脂分化中重要基因表达的影响
• 3.2.3.2 金纳米粒子对OB成骨及横向成脂分化中重要蛋白表达的影响
• 3.2.4 实验结果讨论
• 3.3 金纳米粒子对OB成骨分化过程中细胞表面形态的影响
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.1.1 实验动物
• 3.3.1.2 实验试剂
• 3.3.1.3 实验仪器
• 3.3.1.4 实验样品
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 OB的分离与培养
• 3.3.2.2 扫描电子显微镜（SEM）观察
• 3.3.3 实验结果
• 3.3.3.1 OB成骨分化过程中表面形态的影响
• 3.3.4 实验结果讨论
• 第4章 碳纳米管对MSCs成骨、成脂分化及其功能的影响
• 4.1 碳纳米管对MSCs成骨成脂分化及相关基因表达的影响
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 实验动物
• 4.1.1.2 实验试剂
• 4.1.1.3 实验仪器
• 4.1.1.4 实验样品
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.3 实验结果
• 4.1.3.1 碳纳米管对MSCs增殖的影响
• 4.1.3.2 碳纳米管对MSCs成骨分化早期ALP活性的影响
• 4.1.3.3 碳纳米管对MSCs成骨分化晚期矿化功能的影响
• 4.1.3.4 碳纳米管对MSCs成脂分化的影响
• 4.1.3.5 碳纳米管对MSCs成骨、成脂方向分化中重要基因表达的影响
• 4.1.4 实验结果讨论
• 4.2 碳纳米管对MSCs成骨分化中细胞形态的影响
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 实验动物
• 4.2.1.2 实验试剂
• 4.2.1.3 实验仪器
• 4.2.1.4 实验样品
• 4.2.2 实验方法
• 4.4.2.1 MSCs的分离
• 4.4.2.2 扫描电子显微镜（SEM）观察
• 4.2.3 实验结果
• 4.2.4 实验结果讨论
• 参考文献
• 附录
• 20 nm Au NPs对MSCs成骨分化中基因表达SuperArray分析结果
• 致谢
• 攻读学位期间所得的科研成果