立枯丝核菌AG1-IA诱导玉米差异表达基因的研究

论文摘要

玉米纹枯病是由立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn引起的真菌性病害。尽管该病主要发生在中国和东南亚地区，表现出一定的区域性，但是该病在近年内表现出逐年加重和快速蔓延的趋势，极有可能在未来几年传播到其他国家和地区，并成为一种世界性病害，在我国玉米主产区，该病已成为制约玉米产量高低的主要病害，深入研究玉米对纹枯病的抗病机制，是寻找培育广谱、高效、稳定、持久抗病性品种的有效途径。本研究利用电镜检测技术、抑制消减杂交（SSH）cDNA文库构建技术、反向Northern筛选技术、RT-PCR以及生物信息学分析方法相结合，通过建立相关抗病基因表达谱，从全基因表达的水平上探索玉米对纹枯病的系统抗病机制。 实验所用材料为本课题组多年筛选鉴定出的高耐玉米纹枯病材料R15，纹枯病菌为立枯丝核菌高致病性融合菌群AG1-IA。玉米种子经表面消毒，发芽，温室培育幼苗至五叶期后移入大田，拔节期时采用人工嵌入法将两粒布满菌丝的麦粒接种到植株下位第三叶鞘，接种后接种部位用塑料袋包裹以保温、保湿，接种6小时后取下塑料袋，分别取接种后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的玉米第三下位的叶片和叶鞘，电镜观察菌丝在接种叶鞘组织中的形态变化，提取叶片的总RNA构建SSH差减文库。获得的主要结果如下： 1．采用电镜检测病菌的侵染过程后发现，接种12h后，菌丝在叶鞘细胞表面伸长并生成少量分支；接菌后24h，菌丝交错生长，呈现多分支的网状结构；接菌后36h菌丝继续分支、交错、缠结，形成侵染垫雏形；接种后48h形成成熟侵染垫；接种后60h，侵染垫继续增大，形成团状或带状茵丝团；接种后72h、84h、96h，伴随新一轮的菌丝生长、分支、侵染垫形成等在叶鞘组织上扩展，从而完成对寄主的扩大侵染。另外，在接种24h后的各时间段均观测到菌丝通过侵染钉直接进入寄主或菌丝通过气孔侵入寄主，病原菌大面积侵入寄主是在接菌后36～48h。而在接种72h以后，在叶鞘组织的横断面内发现侵入的菌丝，说明菌丝侵入寄主后能在受侵细胞间扩展。 2．应用数码相机记录病斑扩展过程后发现，接种部位在接种后12h未出现病斑；在接种后24h有水浸状小病斑出现；接种后36h病斑丧失叶绿素而呈白色：接种48h后在形成的白斑周围出现新的水浸状病斑的大面积扩展；接种后60h扩大的病斑丧失叶绿素呈白色，并与之前白色病斑连在一起组成两个明显的病斑；接种后72h，水

论文目录

• 1 前言
• 1.1 纹枯病病原
• 1.2 玉米纹枯病病菌病害的组织病理学
• 1.3 玉米的生育阶段与感病程度
• 1.4 玉米纹枯病病原菌的致病机制
• 1.5 纹枯病抗性机制研究
• 1.6 玉米纹枯病抗性遗传效应的研究
• 1.7 植物抗病研究
• 1.7.1 植物的抗病性
• 1.7.2 植物抗病的分子机理
• 1.7.2.1 信号识别
• 1.7.2.2 信号传导
• 2+信使'>1.7.2.2.1 Ca²⁺信使
• 1.7.2.2.2 cAMP信使
• 1.7.2.2.3 磷脂酰肌醇信使
• 1.7.2.2.4 某些特殊的信号分子
• 1.7.2.2.4.1 水杨酸
• 1.7.2.2.4.2 乙烯
• 1.7.2.2.4.3 活性氧
• 1.7.3 超敏反应
• 1.7.4 植物系统获得抗病性
• 1.7.5 细胞程序化死亡在植物抗病中的研究
• 1.7.6 几种含铁蛋白在植物抗病中的研究
• 1.8 功能基因组学与植物抗病研究
• 1.8.1 mRNA差别显示技术
• 1.8.2 代表性差异显示技术
• 1.8.3 cDNA-AFLP技术
• 1.8.4 cDNA微阵列和DNA芯片技术
• 1.8.5 抑制性差减杂交技术
• 1.9 玉米和水稻的比较基因组分析
• 1.10 本研究的目的意义
• 1.11 实验技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 玉米纹枯病病菌
• 2.2 材料的处理方法
• 2.2.1 纹枯病菌培养
• 2.2.2 纹枯病病菌接种
• 2.3 扫描电镜观察侵染病菌的组织病理学变化
• 2.4 总RNA的提取、检测和cDNA合成
• 2.4.1 总RNA的提取、检测
• 2.4.2 mRNA的分离纯化及cDNA合成
• 2.5 抑制性差减杂交
• 2.5.1 引物和接头序列
• 2.5.2 双链cDNA Rsa Ⅰ酶切
• 2.5.3 接头连接
• 2.5.4 二次差减杂交反应
• 2.5.5 二次抑制PCR
• 2.6 二次PCR产物的纯化回收
• 2.7 差减文库的构建
• 2.8 文库插入片段的检测
• 2.9 差异表达基因cDNA片段的杂交筛选
• 2.10 序列测定及EST序列功能比对
• 2.11 RT-PCR
• 2.12 玉米和水稻比较基因组分析
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米纹枯病病菌的培养
• 3.2 纹枯病病菌侵入过程的电镜观察
• 3.3 接种后发病植株病斑的观察
• 3.4 RNA的提取和检测
• 3.5 mRNA的纯化
• 3.6 抑制性差减杂交的结果
• 3.6.1 cDNA双链合成与Rsa Ⅰ酶切
• 3.6.2 接头连接效率检测
• 3.6.3 消减杂交与抑制PCR
• 3.7 抑制性消减杂交文库的构建
• 3.7.1 T／A克隆与文库构建
• 3.7.2 文库插入片段的检测
• 3.8 文库的反向Northern杂交筛选
• 3.9 阳性克隆的测序和生物信息学功能比对分析
• 3.10 RT-PCR验证功能基因在不同时间段的表达
• 3.11 几个重要候选基因在玉米染色体上的定位研究
• 4 讨论
• 4.1 玉米纹枯病病菌接种后菌丝和植株感病病斑的变化
• 4.2 SSH文库在抗病差异表达基因研究的优势和不足
• 4.3 玉米对纹枯病诱导产生的抗性机制
• 4.3.1 玉米纹枯病诱导的信号传导
• 4.3.2 蛋白酶在玉米纹枯病诱导的抗性机制中的作用
• 4.3.3 超敏反应或细胞凋亡在纹枯病诱导的抗性机制中的作用
• 4.3.4 活性氧在纹枯病诱导的抗性机制中的作用
• 4.3.5 玉米纹枯病诱导的寄主基因转录调控
• 4.4 纹枯病诱导引起产量降低的原因
• 4.5 玉米纹枯病的抗性机制
• 4.6 比较基因组学对重要功能基因的染色体定位和抗性QTL的比较
• 4.7 本试验今后的研究方向
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1：分子生物学试验方法
• 附录2：抑制消减杂交在玉米抗病基因研究中的应用—综述
• 附录3：研究生在读期间发表的文章