论文摘要
卵巢癌（ovarian cancer）是严重危害妇女健康的三大恶性肿瘤之一,其发生率居第3位,但死亡率占据首位。据统计,近年来在我国其发病率有明显上升趋势。在美国每年大约有26,000例上皮性卵巢癌被确诊,有超过1.6万妇女死于这一疾病。卵巢癌的标准化疗方法是紫杉醇（paclitaxel）和卡铂（carboplatin）的联合化疗。不幸的是,由于多药耐药的出现限制了这两种药物的疗效。多药耐药可能是由于细胞膜糖蛋白P-gp的过度表达,也可能是这些药物改变了特定的药物结合蛋白位点（如紫杉醇连接位点的微管蛋白突变）,或者是细胞凋亡阈值的改变。因此,为使用降低凋亡阈值的治疗策略提供了一种潜在的治疗方法来扭转或防止多药耐药情况的发生。白细胞介素6（Interleukin-6, IL-6）最初被认为是一种非特异性B细胞分化因子,诱导B细胞产生免疫活性。随后,IL-6被认为是一种多效性细胞因子,在各种细胞（包括肿瘤细胞）中有着广泛的生物学活性。IL-6通过激活几个靶基因而参与肿瘤细胞的分化、生存、凋亡和增殖。IL-6的抗凋亡作用与BcL-2家族蛋白的表达有关,例如：在骨髓瘤细胞株和患者的骨髓瘤细胞中,疾病的发展与Bcl-XL蛋白上调和血清IL-6水平增加有关。IL-6也与乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌的肿瘤生物学行为有关。药物敏感的乳腺癌细胞中没有IL-6的表达,而多药耐药的乳腺癌细胞则产生高水平的IL-6,这表明IL-6的自分泌与多药耐药有关。更多的证据表明,IL-6是一种自分泌和旁分泌生长因子,在前列腺癌细胞株中可能为顺铂细胞毒性的抑制因子。同样,体外实验表明：对于耐顺铂的肾癌细胞株,顺铂与抗IL-6或抗IL-6受体（IL-6R）抗体联合治疗扭转了对顺铂的耐药。在卵巢癌病人血清中,IL-6以高水平表达,且IL-6的高表达也已经在人类卵巢癌模型中被观察到。对于卵巢癌来说,尽管IL-6作为一个肿瘤标志物较CA125缺少敏感性,但其产生可能与肿瘤的侵袭和预后有关。具体来说,IL-6水平高的患者比正常或低IL-6水平的患者生存期缩短。此外,最近的证据表明,调节IL-6信号传导通路的治疗策略可能直接影响细胞对顺铂和阿霉素的耐药。例如：外源性IL-6的治疗导致肿瘤细胞对细胞毒性药物（包括阿霉素、VP-16和顺铂）产生耐药并抑制这些药物所诱导的细胞凋亡。相反,通过反义寡核苷酸来阻断IL-6可使肿瘤细胞对这些药物敏感。此外,我们及其它实验室的研究也显示,IL-6产物在卵巢癌耐药细胞株中及在卵巢癌病人的血清和腹水中增加。这些数据强有力的支持这个理论,即：IL-6是临床上一种有效的、重要的抗凋亡基因和耐药调节因子。抗IL-6单克隆抗体-siltuximab （CNTO328）是一种化学鼠抗人IL-6单克隆抗体,可中和IL-6的功能,其作用已在不同类型的人类癌症中得到研究。它也被用于临床试验中,且被癌症病人所接受。在这项研究中,研究了siltuximab对紫杉醇耐药的卵巢癌细胞株中IL-6信号传导通路及IL-6介导的基因表达的影响。这项研究对siltuximab和紫杉醇联合治疗卵巢癌提供了更多的证据。研究目的1通过研究IL-6在卵巢癌组织中的表达,了解IL-6信号传导通路的表达激活是否与卵巢癌病人的分期、临床预后及疾病的转归有关；2通过研究siltuximab单克隆抗体对卵巢癌耐药细胞株中IL-6介导的信号传导通路及其基因表达的影响,探讨IL-6信号传导通路的阻断对卵巢癌细胞生长、凋亡及其耐药的分子生物学机制；3通过研究siltuximab单克隆抗体对体内肿瘤生长的影响及与紫杉醇的协同作用,为临床制定靶向阻断IL-6信号传导通路,治疗卵巢癌的新策略提供生物学依据。材料与方法1标本来源选取美国哈佛大学麻省总医院近20年来确诊为卵巢癌的26例患者的癌组织标本,每例患者的标本均包含原发性、转移性和复发性癌组织。2细胞株在这项研究中使用的人卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3均购自美国微生物菌种保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。紫杉醇耐药卵巢癌细胞株SKOV3/TR和CAOV3/TR由美国哈佛大学麻省总医院肿瘤研究中心提供,建株过程如下：把敏感细胞株培养在含有紫杉醇的培养基中,通过逐步提高紫杉醇的含量经过8个月的培养而获得。3主要试剂和仪器兔抗Bcl-XL和MCL-1多克隆抗体、鼠抗磷酸化Stat3（pStat3）和survivin单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technologies公司,鼠抗actin和MTT单克隆抗体购自美国Sigma公司,抗IL-6单克隆抗体siltuximab和非特异性F105抗体是由美国Centocor公司生产。紫杉醇由麻省总医院提供。EclipseTi-U免疫荧光显微镜购自日本尼康公司,多功能酶标仪购自美国MD公司。4实验方法4.1细胞培养研究使用的人卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3、紫杉醇耐药卵巢癌细胞株SKOV3/TR和CAOV3/TR分别培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中,置37℃、5%CO2的培养箱中,每2-3天传代一次。SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞定期培养于含有0.2μmol/l紫杉醇的培养基中,以确认其多药耐药性。用支原体检测试剂盒定期检测所有细胞,以确保其没有被支原体污染。4.2免疫组化法检测卵巢癌患者癌组织中IL-6蛋白的表达情况26例卵巢癌患者的癌组织标本（每例患者均包含原发性、转移性和复发性癌组织）,由美国哈佛大学Dana-Farber/Harvard癌症中心制成组织芯片。取厚度为5μm的组织切片,在60℃恒温箱中烘烤2 h；二甲苯脱蜡15 min,100%乙醇浸泡5 min,95%和70%乙醇中各浸泡5 min使再水化,3%过氧化氢甲醇孵育10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性,抗原修复液修复抗原；常温下磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.5）冲洗3次,在含5%山羊血清和1%胎牛血清的PBS中孵育1 h以封闭蛋白。IL-6抗体用含1%胎牛血清和5%山羊血清的溶液按1：100稀释,4℃过夜；PBS漂洗3次,每次2 min。用免疫组化抗生物素蛋白-生物素复合物（ABC）法检测结合抗体,二甲基联苯胺（DAB）显色,苏木素复染。IL-6蛋白定位于细胞质,IL-6蛋白的表达强度根据染色深度分为4级：无染色者为阴性（-）、浅黄色者为弱阳性（1+）、棕黄色者为中等度阳性（2+）、棕褐色者为强阳性（3+）。1+～3+为IL-6蛋白阳性标本,以此计算阳性表达率。4.3蛋白印迹法检测IL-6处理后SKOV3细胞中pStat3蛋白的表达情况将SKOV3细胞和稳定转染pEGFP-Stat3融合蛋白的肾细胞株BHK-pEGFP-Stat3细胞培养24 h,加入30 ng/ml的IL-6处理1 h,以未经过任何处理的细胞作为空白对照,收获细胞,洗涤,在1×蛋白裂解液（RIPA）中溶解；采用蛋白印迹法检测细胞中pStat3蛋白的表达强度,以β肌动蛋白（β-actin）为内对照。4.4蛋白印迹法检测IL-6联合siltuximab处理后SKOV3细胞中pStat3蛋白的表达情况将SKOV3细胞以每孔2000个细胞接种于6孔板中,过夜。用IL-6（30ng/ml）或不同浓度siltuximab（分别为0.01、0.1、1、10μg/ml）联合IL-6（30 ng/ml）处理1 h,以未经过任何处理的细胞作为空白对照；收获细胞,洗涤,溶解于1×RIPA中；采用蛋白印迹法检测SKOV3细胞中pStat3蛋白的表达强度,以β-actin为内对照。4.5蛋白印迹法检测siltuximab处理后SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞中Stat3介导的抗凋亡蛋白的表达情况SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞用浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml的siltuximab处理,过夜,以未经siltuximab处理的细胞为空白对照；用1×RIPA溶解,收获细胞,洗涤；采用蛋白印迹法检测SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞中抗凋亡蛋白——Bcl-XL、MCL-1、survivin蛋白的表达,以β-actin为内对照。4.6实时荧光技术分析siltuximab联合IL-6处理后SKOV3细胞中pEGFP-Stat3融合蛋白的核转移情况使用脂质体lipofectmine,通过转染的方法建立稳定表达pEGFP-Stat3融合蛋白的肾细胞株BHK-pEGFP-Stat3和卵巢癌细胞株SKOV3-pEGFP-Stat3,将BHK-pEGFP-Stat3和SKOV3-pEGFP-Stat3细胞分别接种于96孔培养板中,每孔接种4000个细胞,37℃培养过夜,分别用0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml的siltuximab处理4 h,再加入IL-6（30 ng/ml）处理1 h,以未经siltuximab处理的细胞为对照。用EclipseTi-U免疫荧光显微镜观察pEGFP-Stat3融合蛋白在细胞内的表达部位。4.7四甲基偶氮唑蓝比色法检测siltuximab处理后SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞对紫杉醇的敏感性将SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMl 1604培养液配成单细胞悬液,以每孔2000个细胞接种于96孔培养板中,加入不同浓度的siltuximab（分别为1、10μg/ml）和紫杉醇（浓度分别为1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 gmol/l）,培养96 h,每孔加入10μl的四甲基偶氮唑蓝（MTT,5mg/ml）溶液,继续培养4 h。置多功能酶标仪于490 nm波长处测定其吸光度（A）值。使用GrapHPad PRISM 4软件绘制反应曲线。当A490降至50%时的紫杉醇浓度即为50%抑制浓度（IC50）,以此表示紫杉醇的敏感性,IC50越小表示对紫杉醇越敏感。4.8基因表达和分析卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3种在100mm的细胞培养板中过夜。然后加入IL-6（30 ng/ml）孵育1 h或细胞预先用siltuximab处理4 h后,再加IL-6处理1h。然后用TRIzol（?）Reagent收集细胞总的RNA。溴化乙锭染色,琼脂糖/甲醛凝胶鉴定RNA的质量。总RNA采用Affymetrix Genechip U133 Plus 2.0 arrays,在哈佛医学院的基因排列技术中心测定基因的表达（http://genome.med.harvard.edu）。该阵列含有超过47,000个转录本的人类基因。通过测量每个基因对23-mers的寡核苷酸序列杂交得到mRNA的表达水平。使用GeneSifter软件分析微阵列的数据。（http://www. genesifter. net/web/）。4.9 TaqMan逆转录聚合酶链反应（TaqMan RT-PCR）进一步测定基因的差异性表达为了测定基因表达,从总RNA样本中,使用特殊的oligo （dT）寡核苷酸引物反转录提取cDNA。产生的cDNA再通过PCR扩增。采用TaqMan UGT2B4 （NM021139）, ATP2B2 （X63575）和β-actin基因作为对照,使用TaqMan Universal PCR Master Mix和StepOnePlus RT-PCR系统进行分析。通过与actin基因表达相比较获得相对的基因表达水平。PCR反应体系包含TaqMan human UGT2B4或ATP2B2和β-actin探针,总体积为20μ1。反应体系如下：95℃10 min,95℃（15 s） 40 cycles和退火/延伸60℃（1 min）。所有的反应均进行三次。4.10测定siltuximab对肿瘤生长及紫杉醇敏感性的影响选用3-4周左右的雌性裸小鼠36只,用于建立紫杉醇耐药卵巢癌细胞株的移植瘤小鼠模型。在移植瘤模型中,为了测定siltuximab对肿瘤细胞生长及对紫杉醇敏感性的影响,第一天用5×106SKOV3/TR和基质胶的混悬液做裸小鼠皮下注射,注射2周后,小鼠被分成6组。第1组用生理盐水腹腔注射,第2组用非特异性抗体F105 （20mg/kg）腹腔注射,第3组用siltuximab （20mg/kg）腹腔注射,第4组用紫杉醇（20 mg/kg）腹腔注射,第5组用紫杉醇（20 mg/kg）和siltuximab （20 mg/kg）作混合腹腔注射。最后一组用紫杉醇（20 mg/kg）和非特异性抗体F105（20 mg/kg）混合腹腔注射。所有的6组小鼠,每周要治疗两次,持续5周。每天检查小鼠健康状况和肿瘤生长情况。用电子数字卡尺（游标卡尺）每周测量两次肿瘤的大小。肿瘤体积（mm3）=（W2×L）/2,其中W为肿瘤宽度,L为肿瘤长度。5统计学分析应用SPSS 16.0软件进行统计学处理,数据以均数士标准差（x±s）表示。计数资料采用X2检验,计量资料的多个样本均数比较应用单因素方差分析,两样本均数比较采用t检验。检验水准α=0.05。结果1 IL-6在转移性和复发性卵巢癌中呈高表达转移性和复发性癌组织中IL-6的阳性表达率分别为69%（18/26）和77%（20/26）,原发性癌组织中IL-6的阳性表达率为23%（6/26）,P<0.05。卵巢癌患者转移性和复发性癌组织中IL-6蛋白的染色强度明显高于原发性癌组织,P<0.05。2 IL-6处理后SKOV3细胞中pStat3蛋白表达增强IL-6处理的SKOV3细胞中pStat3蛋白的表达强度为0.469±0.115,未经IL-6处理的SKOV3细胞中pStat3蛋白的表达强度为0.144±0.103,经IL-6处理组明显高于未经IL-6处理组,P<0.01。3 Siltuximab联合IL-6处理后SKOV3细胞中pStat3蛋白的表达明显下降SKOV3细胞经IL-6处理后,细胞中pStat3蛋白的表达强度（0.525±0.139）明显高于空白对照组（0.106±0.091）,差异具有统计学意义（P<0.01）。Siltuximab（浓度分别为0.01、0.1、1和10μg/ml）联合IL-6处理后,SKOV3细胞中pStat3蛋白的表达强度分别为0.509±0.112、0.204±0.158、0.138±0.103、0.056±0.057,随siltuximab浓度的增加逐渐下降,组间比较差异有统计学意义（F=9.985,P<0.01）。4 Siltuximab处理后SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞中Bcl-XL、MCL-1、survivin蛋白的表达明显降低SKOV3/TR细胞经不同浓度的siltuximab处理后,细胞中Bcl-XL、MCL-1、survivin蛋白的表达强度均明显低于空白对照组,差异有统计学意义（分别为F=5.323, P<0.01; F=5.015, P<0.05; F=3.558, P<0.05）；而Stat3蛋白的表达强度无明显变化,组间比较差异无统计学意义（F=0.922,P>0.05）CAOV3/TR细胞经不同浓度的siltuximab处理后,细胞中Bcl-XL、MCL-1、survivin蛋白的表达强度均明显低于空白对照组,差异具有统计学意义（分别为F=3.973, P<0.05; F=3.372, F<0.05; F=5.710, P<0.01）;而Stat3蛋白的表达强度无明显变化,组间比较差异无统计学意义（F=0.209,P>0.05）5 Siltuximab抑制Stat3蛋白的核转移未经处理的SKOV3-pEGFP-Stat3细胞中,大部分pEGFP-Stat3融合蛋白位于细胞质中；IL-6处理后,pEGFP-Stat3融合蛋白迅速转移到SKOV3-pEGFP-Stat3细胞的细胞核中；siltuximab联合IL-6处理后,pEGFP-Stat3融合蛋白的核转移随siltuximab浓度的增加逐渐减少。在BHKpEGFP-Stat3细胞中也发现类似的结果。6 Siltuximab增加了SKOV3/TR和CAOV3/TR细胞对紫杉醇的敏感性SKOV3/TR细胞经不同浓度的siltuximab（分别为1、10μg/ml）处理后,细胞对紫杉醇的IC50（分别为0.49和0.19μg/ml）明显低于未经siltuximab处理者（0.71μg/ml; P<0.05）; CAOV3/TR细胞经不同浓度的siltuximab处理后,细胞对紫杉醇的IC50（分别为0.0010和0.0008μg/ml）明显低于未经siltuximab处理者（0.0021μg/ml；P<0.01）7 IL-6处理后卵巢癌细胞中不同的表达基因卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3经IL-6处理后许多基因的表达水平发生了改变,其中有506（SKOV3/IL-6）和674（CAOV3/IL-6）个基因上调,有1002（SKOV3/IL-6）和1148（CAOV3/IL-6）个基因降调。Venn diagram显示：27个基因在SKOV3/IL-6和CAOV3/IL-6细胞株中均表现出10倍上调,54个基因均表现出10倍降调。8 Siltuximab处理后IL-6介导的基因表达减弱通过比较单用IL-6处理和siltuximab与IL-6联合处理的细胞株的基因表达图谱,发现经siltuximab处理后许多IL-6介导的基因的表达减弱,分别有634（SKOV3/IL-6/siltuximab）和679 （CAOV3/IL-6/siltuximab）个基因出现10倍降调,31个基因在两种细胞中均表现出10倍降调。9 TaqMan RT-PCR证实了基因的差异性表达选择UGT2B4 （nm021139）和ATP2B2 （x63575）两个在SKOV3/IL-6和CAOV3/IL-6细胞株中均过度表达的基因,评估基因的差异表达。TaqMan RT-PCR结果显示,经siltuximab处理后,IL-6介导的两个基因——UGT2B4 （nm021139）和,ATP2B2（x63575）的表达均减弱。10 Siltuximab单独或与紫杉醇联合治疗对体内肿瘤的生长均无显著影响Siltuximab治疗组与F105对照组肿瘤的生长无明显差别,体积大小的比较差异无显著性（P>0.05）。Siltuximab和紫杉醇联合治疗组移植瘤无明显缩小,与其它单个用药相比肿瘤体积大小无显著性差异（P>0.05）。结论1.IL-6与卵巢癌的发生、发展及耐药性密切相关,IL-6是治疗卵巢癌的重要靶点。2. Siltuximab可有效阻断卵巢癌中的IL-6信号传导通路和IL-6介导的基因表达,具有巨大的应用潜力。3.IL-6的信号传导通路的阻断可能对卵巢癌的治疗有重要作用,但,siltuximab单克隆抗体对体内肿瘤生长的影响及与紫杉醇的协同作用需要进一步的研究,为通过阻断IL-6介导的信号传导通路,探索治疗卵巢癌的新策略提供更多的依据。
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