DAPK和FHIT基因启动子甲基化检测在血液系统肿瘤中的意义

论文摘要

目的研究造血系统肿瘤骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome,MDS）、急性髓细胞性白血病（acute myeloidleukemia,AML）和慢性髓细胞性白血病（chronic myeloid Leukemia,CML）患者中死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase,DAPK）和脆性组氨酸三联基因（fragile histidine triad,FHIT）启动子区域的甲基化状况及其临床相关性。方法建立甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）技术并对59例不同阶段MDS患者、112例AML患者和49例CML患者骨髓标本的DAPK基因甲基化状态进行检测,对54例不同阶段MDS患者骨髓标本的FHIF基因甲基化状态进行检测,分析DAPK和FHIT基因甲基化状态与患者的临床相关性。结果59例MDS患者中37例（62.7%）发生DAPK基因甲基化,DAPK基因甲基化改变与患者的年龄、血象、染色体异常等结果均无相关性,但与患者性别、骨髓原始细胞比例具有显著的相关性（R值分别为0.332和0.346,P值分别为0.010和0.010）。DAPK基因甲基化频率在难治性贫血（refractory anemia,RA）（2/5例,40.0%）、伴多系病态造血的难治性血细胞减少症（refractory cytopeniawith multilineage dysplasia,RCMD）和伴环形铁粒幼细胞的RCMD（refractory cytopenia with multilineage dysplasia with ringedblasts,RCMD-RS）（12/22例,54.5%）、难治性贫血伴有原始细胞增多-1型（refractory anemia with excess blasts-1,RAEB-1）（8/10例,80.0%）、难治性贫血伴原始细胞增多-2型（refractoryanemia with excess blasts-2,RAEB-2）（9/11例,81.8%）、难治性贫血伴有原始细胞增多转化型/急性髓细胞性白血病（refractoryanemia with excess blasts in transformation/acute myeloidleukemi a,RAEBt/AML）（6/8例,75.0%）和5q-综合征（0/3例,0%）之间的差异无统计学意义（x2=10.288,P=0.067）,但5q-综合征、原始细胞正常组（RA/RCMD）和原始细胞增高组（RAEB-1/RAEB-2/AML）之间的差异具有统计学意义（x2=9.824,P=0.007）,并且IPSS中高危组（Int-1/Int-2/High）患者中DAPK甲基化频率明显高于低危组（Low）（分别为35/51例和1/7例,P=0.010）。112例AML患者中82例（73.2%）发生DAPK基因甲基化,DAPK基因甲基化改变与患者的性别、年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、染色体异常类型等结果均无相关性（P＞0.05）。AML各亚型中的DAPK基因甲基化频率分别为66.7%（14/21例,M1）、72.5%（29/40例,M2）、69.2%（9/13例,M3）、90.0%（18/20例,M4）、66.7%（8/12例,M5）、66.7%（4/6例,M6）,DAPK甲基化频率与AML分型之间无相关性（2＞0.05）。49例CML患者中25例（51.0%）发生DAPK基因甲基化,DAPK基因甲基化改变与患者的年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、染色体异常类型等结果均无相关性（P＞0.05）,但与患者的性别具有显著的相关性（R=0.374,P=0.008）。DAPK基因甲基化频率与CML分期之间具有显著的相关性（R=0.354,P=0.013）,甲基化频率在CML各期之间的差异具有统计学意义（x2=8.659,P=0.013）,加速期和急变期患者中DAPK基因甲基化频率明显高于慢性期患者（x2=7.776,P=0.005）。54例MDS患者中26例（48.1%）发生FHIT基因甲基化,FHIT基因甲基化改变与患者的性别、血象、染色体异常等结果均无相关性,但与患者年龄具有显著的相关性（R=0.291,P=0.033）。FHIT基因甲基化频率在难治性贫血/伴有环形铁粒幼细胞的难治性贫血（RA/RARS）（1/6例,16.7%）、RCMD和RCMD-RS（6/19例,31.6%）、RAEB-1（7/11例,63.6%）、RAEB-2（4/7例,57.1%）和RAEBt/AML（8/11例,72.7%）之间的差异无统计学意义（x2=8.417,P=0.077）.但早期阶段（RA/RARS和RCMD）、晚期阶段（RAEB-1和RAEB-2）以及RAEBt/AML患者之间的差异具有统计学意义（x2=7.938,P=0.019）,并且FHIT基因甲基化频率与IPSS分组预后危险程度也具有显著的正相关性（x2=10.110,P=0.018）。结论DAPK基因甲基化可能是促进造血系统肿瘤MDS、AML和CML发生发展的分子事件之一;FHIT基因甲基化可能是促进MDS疾病进展的分子事件之一;并且是MDS患者预后不良的一个影响因素。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 常见造血系统肿瘤中的甲基化状况
• 1.1.1 急性髓细胞白血病
• 1.1.2 慢性髓细胞白血病
• 1.1.3 骨髓增生异常综合征
• 1.1.4 淋巴系统肿瘤
• 1.2 展望
• 第二章 本论文研究的目的、方法、实验方案的设计、意义
• 2.1 研究目的
• 2.2 研究方法及技术
• 2.2.1 MSP的引物设计原理
• 2.2.2 MSP的引物设计注意要点
• 2.2.3 FHIT基因和DAPK基因的MSP引物
• 2.3 实验方案的设计
• 2.4 本研究的意义
• 第三章 髓系肿瘤患者DAPK基因启动子甲基化改变的研究
• 3.1 材料和仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 MDS病例资料
• 3.1.1.2 AML病例资料
• 3.1.1.3 CML病例资料
• 3.1.1.4 正常对照
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 骨髓单个核细胞分离和DNA制备
• 3.2.2 DNA修饰
• 3.2.3 DAPK基因甲基化检测
• 3.2.4 PCR产物回收与纯化
• 3.2.5 重组载体构建
• 3.2.6 重组质粒转化
• 3.2.7 重组质拉提取
• 3.2.8 质粒鉴定、测序
• 3.2.8.1 质粒鉴定
• 3.2.8.2 测序
• 3.2.9 细胞遗传学检查
• 3.2.10 统计
• 3.3 结果
• 3.3.1 MDS患者中DAPK基因甲基化结果
• 3.3.1.1 MDS患者中DAPK基因甲基化频率
• 3.3.1.2 DAPK基因甲基化频率与MDS亚型的关系
• 3.3.2 AML患者中DAPK基因甲基化结果
• 3.3.2.1 AML患者中DAPK基因甲基化频率
• 3.3.2.2 DAPK基因甲基化频率与AML亚型的关系
• 3.3.3 CML患者中DAPK基因甲基化结果
• 3.3.3.1 CML患者中DAPK基因甲基化频率
• 3.3.3.2 DAPK基因甲基化频率与CML分期的关系
• 3.3.4 正常对照中DAPK基因甲基化结果
• 3.4 讨论
• 第四章 MDS患者FHIT基因启动子甲基化改变的研究
• 4.1 材料和仪器
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 MDS患者中FHIT基因甲基化频率
• 4.3.2 FHIT基因甲基化频率与MDS亚型的关系
• 4.3.3 Kaplan-Meier生存分析
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的文章