CD4+CD25+调节性T细胞在白癜风发病中的作用的研究

论文摘要

白癜风是一种原发性的、局限性或泛发性皮肤色素脱失症，是由于皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酶系统的功能减退、丧失而引起的。白癜风可能是由于遗传素质和免疫因素联合作用所致的一种皮肤病，确切发病机制尚未完全阐明，目前有多种假说。白癜风的自身免疫学说受到越来越多的关注。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg or Tr）是目前免疫学领域的研究的热点之一。调节性T细胞（Treg）为抑制性T细胞（Ts细胞）的亚群，为某些组成性表达CD25的CD)4+T细胞。调节性T细胞（Treg）所具有的免疫抑制特性使得其在自身免疫性疾病的调节中具有广泛的应用前景。CD4+Treg细胞来源于胸腺，在正常人外周血中约占CD4+T细胞的5-10％。天然CD4+Treg细胞持续高表达CD25+分子，正常状况下能够抑制自身反应性T细胞的活化、增殖、分化及其功能。叉头螺旋转录因子（Foxp3）是新近发现的转录因子，属于forkhead家族成员，组成性表达于机体的CD4+CD25+T调节细胞，介导Treg细胞在胸腺的发育、外周血表达及功能维持。CD4+CD25+T调节细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性，其免疫无能性表现在对高浓度白介素-2（IL-2）的单独刺激、固相包被或可溶性抗CD3单抗、以及抗CD3单抗和抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也不分泌白介素-2（IL-2）。其免疫抑制性表现在Treg细胞的激活需要经过T细胞受体（TCR）和辅助信号刺激，具有抗原特异性，但是一旦被激活，其抑制活性是非特异性的，可通过细胞之间直接接触、也可通过分泌白介素-10（IL-10）和转化生长因子1（TGF-β1）而对局部免疫反应产生抑制，而且免疫抑制不具有组织相容性符合体（MHC）限制性。细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）属于B7／CD28家族成员，具有下调免疫应答为主的多种免疫学效应。近年研究发现CD4+CD25+调节性T细胞胞内组成性表达CTLA-4。CTLA-4的表达在T细胞上研究较多，在静息细胞少表达或者无表达，活化后由于细胞内再分布及合成增多而表达增多。体内静止未致敏T细胞虽然用PCR方法可以检测到CTLA-4的mRNA，但是无论在体内和体外，其蛋白质只有在T细胞激活24小时后方可检测到，并在36-48小时达峰值，96小时恢复至本底水平。与CD28不同，CTLA-4主要存储于细胞的囊泡，特别是细胞核周围的高尔基体上，在相同细胞表面只有CD28的2％-3％。当细胞激活后，细胞内存储的CTLA-4重新集聚于细胞表面。CD4+CD25+Tr细胞活化后，膜表面细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）表达增加，并持续增加；应用抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）单抗能阻断CD4+CD25+Tr细胞的抑制性调节作用，故一般认为CD4+CD25+Tr细胞通过与靶细胞直接接触而发挥效应。糖皮质激素诱导的TNF受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor，GITR）是肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）中的第18个成员，是胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）上的一个表面分子，其配体为GITRL。主要是由调节性T细胞（Treg），即CD4+CD25+淋巴细胞表达的，6ITR和CTLA-4分子可促进转录因子Foxp3 mRNA的表达。研究表明，Foxp3的表达是Treg细胞活化的结果，可作为Treg细胞的一个特异标志。然而，国内尚未有白癜风患者CD4+CD25+调节性T细胞表达的报道。国外已有关于白癜风患者外周血淋巴细胞的报道，但结果不一致。目的：探讨CD4+CD25+调节性T淋巴细胞在白癜风发病中的作用；方法：Vitiligo patients1．分别取白癜风患者及正常人外周血，密度梯度离心法分离外周血单一核淋巴细胞（PBMC）；2．用Dynabeads阳性分选PBMC中的CD8+T细胞，然后用DETACHaBEAD去除CD8+T细胞上的珠子；采用Miltenyi免疫磁珠阴性分选CD4+T细胞，通过抗CD25的免疫磁珠分选总CD4+T细胞，将CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞分开。3．用流式细胞仪检测不同组CD4+CD25+调节性T细胞的比例；4．同样方法检测不同阶段白癜风患者CD4+CD25+调节性T细胞的比例是否存在差异；5．提取不同组总RNA，设计引物，采用RT-PCR在基因水平检测Foxp3、CTLA-4及GITR的表达情况，采用Western-blot在蛋白水平检测Foxp3的表达情况。6．统计分析：以SPSS11．0统计软件对所有试验数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，当P<0．05时，差异具有统计学意义。结果：1．本研究采用流式细胞仪对39例白癜风患者进行了CD4+CD25+调节性T细胞的检测，我们的结果显示进展期白癜风患者外周血CD4+CD25+T淋巴细胞百分比明显低于正常人外周血CD4+CD25+T淋巴细胞百分比，且差异有统计学意义，经NB-UVB治疗后3级复色的白癜风患者CD4+CD25+T淋巴细胞百分率高于进展期白癜风患者，也具有统计学意义，提示CD4+CD25+Treg细胞可能在白癜风发病机制中起一定的作用。治疗后白癜风患者CD4+CD25+T淋巴细胞百分率较正常人偏低，但无统计学意义。2．采用RT-PCR测定Foxp3、CTLA-4及GITR的mRNA表达水平，采用Western-blot测定Foxp3蛋白表达水平，结果表明与正常人相比，活动期患者Foxp3、CTLA-4及GITR的表达下降，且差异有统计学意义。经NB-UVB治疗后3级复色的白癜风患者CD4+CD25+Treg细胞比例与正常人也有显著性差异，但标志其活化的Foxp3表达较正常人低，提示经NB-UVB治疗后3级复色的白癜风患者CD4+CD25+Treg细胞数量正常，但其功能有异常。这些结果提示CD4+CD25+Treg细胞可能在白癜风发病机制中起一定的作用。结论：为探讨CD4+CD25+调节性T细胞在白癜风发病中的作用，本研究结果表明经NB-UVB治疗后显效的白癜风患者CD4+CD25+Treg细胞比例与正常人无显著性差异，但标志其活化的Foxp3表达较正常人低，提示经NB-UVB治疗后3线复色的白癜风患者CD4+CD25+Treg细胞数量正常，但其功能有异常。这些结果提示CD4+CD25+Treg细胞可能在白癜风发病机制中起一定的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 白癜风发病机制的研究背景
• 1.1.1 白癜风遗传学研究进展
• 1.1.1.1 遗传流行病
• 1.1.1.2 白癜风与HLA的关系
• 1.1.1.3 与白癜风相关的其他易感基
• 1.1.2 白癜风免疫学研究进展
• 1.1.2.1 白癜风与体液免疫
• 1.1.2.2 白癜风与细胞免疫
• 1.1.2.3 白癜风与细胞因子
• 1.1.3 白癜风与神经机制
• 1.2 本课题的研究意义及主要内容
• 第二章 白癜风患者CD4+CD25+调节性T细胞的检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要的仪器及试剂
• 2.2.2 实验对象
• 2.2.3 疗效评价
• 2.3 技术路线
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 方法
• 2.4.2 数据分析
• 2.4.3 统计学处理
• 2.5 实验结果
• 2.5.1 不同分期的白癜风患者CD4+CD25+调节性T细胞流式细胞仪分析
• 2.5.2 不同分期的白癜风患者CD4+CD25+调节性T细胞流式细胞仪统计分析结果
• 2.6 讨论
• 第三章 白癜风患者治疗前后Foxp3表达水平的检测
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要的仪器及试剂
• 3.2.2 实验对象
• 3.3 技术路线
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 离心法分离外周血淋巴细胞
• 4⁺CD₂₅⁺T淋巴细胞'>3.4.2 免疫磁珠法分离CD₄⁺CD₂₅⁺T淋巴细胞
• 3.4.3 总RNA的提取
• 3.4.4 cDNA的合成
• 3.4.5 RT-PCR产物的检测
• 3.4.6 Western-blote
• 3.4.6.1 胞内总蛋白的提取
• 3.4.6.2 蛋白SDS-PAGE分析
• 3.4.6.3 Western blotting
• 3.4.7 统计学处理
• 3.5 实验结果
• 3.5.1 总RNA的提取
• 3.5.2 RT-PCR检测白癜风患者Foxp3的表达
• 3.5.3 Western blote检测白癜风患者Foxp3蛋白的表达
• 3.6 讨论
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 攻读学位期间成果及论文
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明