论文摘要
背景和目的食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在我国食管癌的死亡率居恶性肿瘤的第四位。氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）是食管癌的常规化疗药物,然而,化疗耐药仍是影响化疗疗效和患者预后的重要因素。核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）,是一类重要的核转录因子,主要形式为p50和p65组成的二聚体,p50是与DNA结合的部位,p65参与基因转录的起始调节,并可促进p50与DNA结合,抑制其活性能促进肿瘤细胞发生凋亡,提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。COX-2的启动子含有两个NF-κB结合位点,NF-κB可以通过作用于这些结合位点,调节COX-2基因转录、蛋白表达。Ki-67抗原为细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原,是一个反映细胞增殖的敏感指标。己酮可可碱（pentoxifvlline,PTX）,为磷酸二酯酶抑制剂,可以抑制IκBa的磷酸化及其降解,从而抑制NF-κB的活性。因此,PTX在肿瘤治疗中的作用已引起人们的广泛关注。而PTX对体外培养肿瘤细胞的直接作用和对NF-κB的表达影响,国内外尚未见报道。本研究采用光学显微镜观察,生长曲线绘制,MTT测定分析PTX对人食管癌细胞株EC9706的影响;并采用免疫细胞化学染色SP法检测PTX作用EC9706细胞24h后NF-κBp65及cox-2、ki-67蛋白的表达情况;采用光学显微镜观察,MTT测定对比5-Fu和PTX联合5-Fu对EC9706细胞的抑制作用,为寻找治疗食管癌的新方法提供实验依据。材料和方法人食管癌细胞株EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠,引自河南省肿瘤病理重点实验室冻存细胞。将不同浓度的PTX作用于EC9706细胞,采用光学显微镜观察细胞形态的改变,生长曲线绘制观察细胞的生长情况,用MTT法检测细胞的抑制率;并采用免疫细胞化学染色SP法检测FFX作用EC9706细胞24h后NF-κBp65及COX-2、Ki-67蛋白的表达情况;将不同浓度的5-Fu和PTX联合5-Fu作用于EC9706细胞,采用光学显微镜观察细胞形态的改变,用MTF法对比检测5-Fu和PTX联合5-Fu对食管癌EC9706细胞的抑制率。统计学分析采用SPSS 10.0软件,实验结果采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,t检验。取a=0.05为检验水准。结果1.FTX作用后细胞形态学观察12～72h结果显示,FTX 0.01mg/ml处理组与对照组相似。PTX 0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml组随时间延长,细胞数量逐渐增多,但与对照组相比,随浓度增加细胞增长速度变慢,细胞间结构松散,胞质浑浊。2.PTX作用后细胞生长曲线显示,各PTX处理组EC9706细胞的增殖受到一定程度抑制。各PTX处理组EC9706细胞数量仍是随时间延长逐渐增多,但与对照组相比,细胞数量明显减少,并随剂量的增加和时间的延长其抑制作用越来越明显。3.MIT法测量PTX作用于EC9706细胞的抑制率显示,不同浓度的PTX（0.01～1.0mg/ml）作用于EC9706 12h、24h、48h、72h,各组抑制率均数的比较有统计学意义（F=40.745,P＜0.05）。其中PTX 0.01mg/ml组与对照组比较,48h后差异具有显著性（P＜0.05）;PTX 0.1、0.5、1.0mg/ml组在各时间点与对照组比较,其差异均具有显著性（P＜0.05）。4.NF-κB P65蛋白在PTX作用EC9706细胞24h后,细胞阳性率逐渐下降,对照组与PTX各组细胞阳性表达率分别为90.33±1.53%、87.67±1.15%、83.00±2.65%、73.33±3.79%、61.00±2.00%,差异有统计学意义（F=74.437,P＜0.01）。PTX0.01mg/ml组与对照组比较,细胞阳性率无显著性差异（P＞0.05）,其余各组间两两比较,细胞阳性率均有显著性差异（P＜0.05）。5.COX-2蛋白在PTX作用EC9706细胞24h后,细胞阳性率逐渐下降,对照组与PTX各组细胞阳性表达率分别为90.33±1.53%、86.00±2.65%、78.33±3.06%、70.33±5.03%、56.33±6.66%,差异有统计学意义（F=30.966,P＜0.01）。PTX0.01mg/ml组与对照组比较,细胞阳性率无显著性差异（P＞0.05）,其余各组间两两比较,细胞阳性率均有显著性差异（P＜0.05）。6.Ki-67蛋白在PTX作用EC9706细胞24h后,细胞阳性率逐渐下降,对照组与PTX各组细胞阳性表达率分别为63.33±10.69%、43.00±4.58%、32.33±5.86%、23.33±3.05%、14.67±9.02%,差异有统计学意义（F=20.496,P＜0.01）。PTX各组与对照组比较,细胞阳性率均有显著性差异（P＜0.05）,PTX0.01mg/ml组与0.1mg/ml组、PTX0.1mg/ml组与0.5mg/ml组、PTX0.5mg/ml组与1.0mg/ml组比较,细胞的阳性率无显著性差异（P＞0.05）。7.5-Fu、PTX联合5-Fu作用12～72h后光学显微镜下观察细胞形态学改变,经5-Fu处理组细胞,24h出现部分细胞皱缩,漂浮,胞质浑浊,并随时间延长和药物浓度增高,数量渐少,出现细胞碎片。而PTX和5-Fu联合处理组细胞,12h即出现与单用5-Fu处理组24h细胞相似变化,并随时间延长和药物浓度增高,细胞数量更少,出现大量漂浮细胞和细胞碎片。8.MTT法测量5-Fu、PTX联合5-Fu作用EC9706细胞的抑制率结果显示,不同浓度的5-Fu、PTX联合5-Fu作用于EC9706 12h、24h、48h、72h,同一时间各组抑制率差异有统计学意义（P＜0.01）。12h联合组Ⅰ-Ⅳ与5-Fu25μg/ml组,联合组Ⅵ-Ⅷ与5-Fu50μg/ml组,差异具有显著性（P＜0.05）。24h联合组Ⅰ-Ⅳ与5-Fu25μg/ml组,联合组Ⅴ-Ⅷ与5-Fu50μg/ml组,差异具有显著性（P＜0.05）。48h联合组Ⅱ-Ⅳ与5-Fu25μg/ml组,联合组Ⅷ与5-Fu50μg/ml组,差异具有显著性（P＜0.05）。72h联合组Ⅲ-Ⅳ与5-Fu25μg/ml组,联合组Ⅴ-Ⅷ与5-Fu50μg/ml组比较,差异具有显著性（P＜0.05）。联合组Ⅲ、Ⅳ与5-Fu50μg/ml组在24h、48h、72h,不具有显著性差异（P＞0.05）。结论1.PTX对EC9706细胞的增殖有一定的抑制作用,并随药物浓度增加和时间延长,其抑制作用逐渐增强。2.PTX使EC9706细胞的NF-κB P65、COX-2、Ki-67蛋白表达下降,提示PTX可抑制EC9706细胞NF-κB及其下游基因COX-2活性,抑制肿瘤细胞的增殖。3.同一5-Fu浓度,随着PTX药物浓度的增加,5-Fu对EC9706细胞的抑制作用也增强,PTX0.5mg/ml、1.0mg/ml与5-Fu25μg/ml联合组与5-Fu50μg/ml组对EC9706细胞抑制作用相近,提示PTX可以增加EC9706细胞对5-Fu的敏感性,减少5-Fu的剂量。
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