藏药镰形棘豆的抗炎活性及化学成分研究

论文摘要

本论文从文献、生药学、药理、化学四个方面对藏药镰形棘豆进行了研究。第一部分:文献研究对棘豆属植物的化学成分和药理活性进行了系统的文献研究。目前对棘豆属植物的化学成分的研究主要集中在小叶棘豆、小花棘豆和黄花棘豆等少数几种上,而对民间常用、疗效确切的镰形棘豆、轮叶棘豆、砂珍棘豆等仅有少量报道或未见报道,此外对棘豆属药用植物的药理作用和活性筛选研究非常缺乏、方向单一。因此,从总体上说,目前国内外对棘豆属植物的研究尚属于起步阶段,对其药理作用及相关活性物质基础以及两者的相关性等几个方面的研究有待深入。第二部分:生药学研究本章从性状、显微和理化鉴别等几个方面对镰形棘豆药材进行了生药学研究,首次观察并描述了其根和花等药用部位的显微特征;此外,还增加了镰形棘豆药材中生物碱和皂苷类化合物的理化鉴定方法。以上研究为镰形棘豆药材的准确鉴定提供了依据。第三部分:药理研究1.急性毒性LD50实验中,给予剂量为1.2、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0g/kg的镰形棘豆总提物（EOF,最高相当于人常用剂量的667倍）,没有小鼠死亡,且动物的精神状态和体重未出现异常变化,表明该药物单次口服比较安全。2.EOF的镇痛活性在醋酸扭体试验中,不同剂量的EOF均可使小鼠扭体次数明显减少,其中高剂量组的效果最佳（1200mg/kg,57.2%,p＜0.001）,且显著高于其它两个剂量组（600mg/kg和300mg/kg,p＜0.01）;在热板试验中,EOF并不能降低小鼠对热刺激的反应性,而阳性药物吗啡则可以完全抑制小鼠的反应;在福尔马林试验中,EOF对由福尔马林诱发的第一相疼痛（0～5min）并没有产生明显的影响,而对于第二相疼痛（15～30min）则发挥了非常显著的抑制作用（p＜0.01）,最高抑制率达到40.1%（1200mg/kg）。由此可见,EOF具有良好的外周镇痛作用。3.EOF的抗炎活性在小鼠耳肿胀试验中,低、中、高剂量的EOF可不同程度地抑制由二甲苯诱导的小鼠耳肿胀,效果显著,其中高剂量组的抑制率达58.0%,与空白组相比差异极为显著（p＜0.001）;在卡拉胶诱导的腹腔炎试验中,EOF可显著抑制小鼠腹腔白细胞的迁移,最高抑制率为59.4%（1200mg/kg）,并且与空白组有极显著差异（p＜0.001）;在慢性棉球肉芽肿试验肿,EOF对大鼠棉球肉芽肿模型的增生反应具有较好的抑制作用,统计学分析显示,给药剂量为1200mg/kg时（抑制率为49.2%）,其疗效与吲哚美辛（抑制率为55.2%）没有显著差别（p＞0.05）。由此可见,EOF对急性炎症和慢性炎症都有较好的效果。4.镰形棘豆抗炎活性部位筛选以TPA诱导的小鼠耳肿胀模型和卡拉胶引起的小鼠腹腔炎模型为平台,对镰形棘豆挥发油、总黄酮、总生物碱、总皂苷、总多糖等五个部位进行抗炎活性筛选,结果发现,镰形棘豆总黄酮的抗炎效果最佳（对耳肿胀度和腹腔白细胞迁移的抑制率分别为61.1%和56.4%）,与阳性药吲哚美辛（10mg/kg）相比没有明显差异。在小鼠耳肿胀实验中,其抑制率超过了吲哚美辛（58.6%）,显示了优良的抗炎效果。此外,镰形棘豆总生物碱也具有一定的抗炎效应,但是效果不及总黄酮和阳性药物。5.镰形棘豆总黄酮抗炎作用机理的初步研究在大鼠足肿胀实验中,sc卡拉胶后,模型组大鼠的血清和致炎足组织中PGE2的含量大幅上升,经总黄酮治疗,PGE2含量明显降低（抑制率分别为38.2%和47.5%）,但不能在6.5h内恢复到正常水平。在该试验中,模型组炎性组织和血液中的MDA含量显著升高,经治疗后,MDA的含量虽然有所降低,但是没有统计学意义。由此推测,镰形棘豆总黄酮可能主要通过抑制COXs的活性而不是通过抑制自由基的产生发挥抗炎活性。第四部分:化学研究1.镰形棘豆中化学成分的系统分析挥发油、黄酮类、生物碱类、皂苷类和多糖类化合物在镰形棘豆药材中所占比例较大,是其主要的化学成分。2.供抗炎活性筛选部位的分离从镰形棘豆药材分离得到了总黄酮（纯度为83.7%,得率为2.56%）、总皂苷（纯度为68.3%,得率为0.89%）、总多糖（纯度为85.5%,得率为2.26%）、挥发油（得率为1.34%）以及总生物碱（得率为1.45%）等五个供抗炎活性筛选的部位。3.单体化合物分离与鉴定利用常压硅胶柱层析法和半制备HPLC对镰形棘豆乙醇提取物的石油醚、氯仿和乙酸乙酯三个萃取部位的化学成分进行分离和纯化,共计得到单体化合物33个,通过理化方法和UV、MS和NMR等波谱方法对其进行结构分析,鉴定了其中的30个化合物,分别为正二十九烷（A1,n-nonacosane）、花生酸（A2,eicosanoic acid）、β-谷甾醇（A3,β-sitosterol）、球松素（B4,pinostrobin）、2’,4’-二羟基二氢查儿酮（B5,2’,4’-dihydroxy dihydrochalcone）、2’,4’-二羟基查儿酮（B6,2’,4’-dihydroxy chalcone）、乔松素（B7,pinocembdn）、豆甾醇（B8,stigmasterol）、2’-羟基-4’-甲氧基查儿酮（B9,2’-hydroxy-4’-methoxy chalcone）、7-羟基二氢黄酮(B10/C19,7-hydroxy flavonone)、ψ-赝靛素(B12,ψ-baptigenin)、芒柄花素(B13,formononetin)、甘草素(B14,liquiritigenin)、2’-甲氧基-4’-羟基查儿酮(B15,2’-methoxy-4’-hydroxy chalcone)、白杨素(C16,chrysin)、染料木素(C17,genistein)、芹菜素(C18,apigenin)、2’,4-二羟基-4’-甲氧基查儿酮(C20,2’,4-dihydroxy-4’-methoxy chalcone)、木犀草素(C21,luteolin)、苯乙基肉桂酰胺(C22,phenethyl cinnamide)、3’,7-二羟基-2’,4’-二甲氧基异黄烷(C23,3’,7-dihydroxy-2’,4’-dimethoxy isoflavane)、7-羟基黄酮(C24,7-hydroxyflavone)、2’-羟基苯乙基肉桂酰胺(C26,2’-hydroxy phenethyl cinnamide)、异甘草素(C28,isoliquiritigenin)、异鼠李素(C29,isorhamnetin)、槲皮素(C30,quercetin)、杨梅素(C31,myricetin)、山奈酚(C32,kaempferol)、邻苯二甲酸二异丁酯(C33,diisobutyl phthalate)和β-胡萝卜苷(C34,β-daucosterol)。其中,A1、A2、B4、B7、B8、B10/C19、B12、B13、B14、C16、C18、C20、C21、C22、C24、C26、C30、C31和C33等19个化合物为首次从镰形棘豆中分离得到;A2、B4、B7、B10/C19、B12、B13、B14、C20、C24和C33等10个化合物为首次从棘豆属植物中分离得到。此外,还有1个生物碱类化合物和2个黄酮类化合物的结构尚未确定。4.镰形棘豆中黄酮苷元类化合物的含量测定选择了藏药镰形棘豆中5种含量较高的黄酮苷元（5-羟基-7-甲氧基二氢黄酮、2’,4’-二羟基二氢查儿酮、2’,4’-二羟基查儿酮、5,7-二羟基二氢黄酮和7-羟基二氢黄酮）,通过对检测波长、流动相组成、色谱柱等影响因素的优选,建立了一套简便易行、稳定准确、分离效果好的分析方法。即:色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8（5μm,4.6mm×150mm）;流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脱程序为0～50min,A由75%降至50%,50～60min,A由50%降至40%,60～65min,A由40%升至75%,65～70min,A保持75%;流速为1.0mL/min;检测波长为280nm(B4、B5、B7、B10)和365nm（B6）;柱温为20℃;进样量为5μL。在该条件下,B4、B5、B6、B7、B10分别在0.101～0.707μg、0.029～0.203μg、0.332～2.324μg、0.134～0.938μg和0.122～0.854μg范围内呈现良好的线性关系,相关系数r分别为0.9996、0.9998、0.9998、0.9996和0.9998,其精密度（n=6）处于0.61%～1.64%之间;该方法的重复性良好（n=5,RSD＜2%）,且样品溶液在48h内性质稳定;该方法的平均回收率在96.9%～101.2%之间,RSD均小于2%;测定了三个产地（青海共和县、西藏班戈县、甘肃酒泉县）的镰形棘豆样品中各黄酮苷元的含量,其中B4的含量分别为0.16%、0.17%和0.09%;B5的含量分别为0.04%、0.05%个0.02%;B6的含量分别为0.64%、0.73%和0.45%;B7的含量分别为0.32%、0.48%和0.30%;B10的含量分别为0.20%、0.16%和0.10%。由此可见,三个产地样品中各黄酮苷元的含量有一定差别,以青海共和县与西藏班戈县两个产地的比较接近,而甘肃酒泉县的样品中,这5种黄酮的含量均为最低;5种黄酮苷元含量的总和,以西藏班戈县产最高,青海共和县次之,甘肃酒泉县最低。

论文目录

• 作者简介
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 绪论
• 参考文献
• 第二部分 文献研究
• 前言
• 第一章 棘豆属植物的化学成分研究概况
• 第一节 黄酮类化学成分
• 第二节 三萜类化学成分
• 第三节 生物碱类化学成分
• 第四节 其它类化学成分
• 第二章 棘豆属植物的药理活性研究概况
• 第一节 抗肿瘤活性
• 第二节 抑菌活性
• 第三节 抗病毒活性
• 第四节 其它药理作用
• 第三章 小结
• 参考文献
• 第三部分 实验研究
• 第一章 镰形棘豆的生药学研究
• 第一节 基源鉴定
• 第二节 性状鉴别
• 第三节 显微鉴别
• 第四节 理化鉴别
• 第五节 小结
• 第二章 镰形棘豆总提物的镇痛抗炎活性研究及化学成分的系统分析
• 第一节 镰形棘豆总提物的急性毒性研究
• 第二节 镰形棘豆总提物的镇痛抗炎活性研究
• 第三节 镰形棘豆的化学成分系统分析
• 第四节 小结与讨论
• 第三章 镰形棘豆抗炎有效部位的筛选与作用机理初步研究
• 第一节 镰形棘豆抗炎有效部位的筛选
• 第二节 镰形棘豆抗炎有效部位的作用机理初步研究
• 第三节 小结与讨论
• 第四章 镰形棘豆的化学成分研究
• 第一节 镰形棘豆化学成分的分离
• 第二节 镰形棘豆中黄酮类化合物的鉴定
• 第三节 镰形棘豆中有机酰胺类化合物的鉴定
• 第四节 镰形棘豆中其它成分的鉴定
• 第五节 镰形棘豆中黄酮苷元类化合物的含量测定
• 第六节 本章小结
• 参考文献
• 第四部分 全文总结与展望
• 致谢
• 附录