灰树花漆酶高产菌株的发酵及其酶学性质研究

论文摘要

随着科技的日益进步,人们不但对高水平的生活追求提高了,而且对生活环境以及环保要求提到了前所未有的高度。漆酶作为一种纯天然,无污染的材料在生活中的应用日益广泛,并且不断的被人们所认可。本实验首次用液体发酵法对食用菌灰树花进行漆酶研究,液体发酵优点在于,生长周期短、污染少、环境可控,得到的灰树花漆酶的酶活最高达到17990U/mL。完全可以应用于工业大规范生产。本文主要研究了以下三方面内容:1.样品制备稳定性的研究灰树花发酵产漆酶的最佳时间为10天;在不同温度下,该酶的反应速度以及耐受情况都表现不同的活力,漆酶的最适温度约为40℃;漆酶在不同的pH下,其表现活性不同,pH1.8-3.0都表现出较高活力,在pH3.0达到最高活力,3.0为其最适反应pH;可以看出0℃～40℃条件下漆酶相对稳定,相对剩余酶活较高,当温度在40℃时相对剩余酶活力最高,为89%,温度大于40℃后酶活迅速下降,60℃时相对酶活仅为40%漆酶在pH2.8-3.4时酶活力表现很强的稳定性,并且相对酶活力都在60%以上,但是当超过pH超过3.4时,相对酶活急剧下降,随着pH的继续增大到5.2的时候,相对酶活继续下降为20%;金属离子对漆酶活力的影响:Cu2+,Co2+对漆酶有显著的激活作用,Fe3+对酶活有一定的抑制作用,而Ag-则完全抑制漆酶的活性,Na+、K+、Mg2+、Zn2+对酶影响相对Cu2+,Co2+不大。灰树花粗漆酶沉淀比较丹宁法,乙醇法,丙酮法,硫酸铵法,从得率和纯度上得出硫酸铵沉淀法最适合。2.灰树花漆酶的液体发酵条件的研究优化应用正交实验、均匀分析灰树花漆酶的液体发酵条件。结论得出:灰树花菌株摇瓶振荡培养产生的漆酶比静止培养产生的漆酶活力高,摇床培养10天,装液量为50mL/250mL,转速为120r/min时漆酶活力最高。通过设计正交实验,用SPSS软件分析的结果可以明显的看出:灰树花产生的漆酶的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨,最适温度为26℃,最适pH值为3.0,最适产酶培养基:葡萄糖10g蛋白胨5g,添加Na2HPO40.475g、KH2PO40.453g、MgSO4.7H2O 0.5g、CaCl2.2H2O 0.013g、酵母提取物1 g、VB1 25mg、痕量溶液1ml,最后定容至1000m L.灰树花产生的漆酶的酶活最高达到17990U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 真菌漆酶的概述
• 1.1 真菌漆酶的结构及催化反应机理
• 1.1.1 真菌漆酶的分子结构特征
• 1.1.2 真菌漆酶的催化反应机理
• 1.1.3 真菌漆酶的活性中心
• 1.1.4 真菌漆酶的底物
• 1.2 真菌漆酶的应用
• 1.2.1 在环境中的应用
• 1.2.2 生物漂白和脱色
• 1.2.3 食品加工
• 1.2.4 生物检测
• 1.2.5 在能源领域的应用
• 1.2.6 其它因素对酶收率的影响
• 2 真菌漆酶发酵研究进展
• 2.1 真菌漆酶的基因结构与表达
• 2.2 影响真菌漆酶合成的条件
• 2.2.1 碳源和氮源对真菌漆酶合成的影响
• 2.2.2 金属离子对真菌漆酶合成的影响
• 2.2.3 培养方式培养基培养条件对漆酶合成的影响
• 2.3 真菌漆酶菌种的筛选和选育
• 2.4 其他因素
• 第二章 样品制备稳定性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.2.1 菌种扩大培养和斜面保藏培养基
• 1.2.2 菌株产酶筛选培养基（基础培养基）
• 1.2.3 液体产酶培养基（/L）
• 1.3 常见菌株产漆酶活力检测
• 1.4 培养方法和酶液制备
• 1.5 漆酶活力测定
• 1.6 酶的最适反应温度
• 1.7 酶的最适反应pH
• 1.8 酶的热稳定性
• 1.9 酶的pH稳定性
• 1.10 金属离子对漆酶活力的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 灰树花发酵中的酶活变化
• 2.2 酶的最适反应温度
• 2.3 酶的最适反应pH
• 2.4 酶的热稳定性
• 2.5 酶的pH稳定性
• 2.6 金属离子对其酶活力的影响
• 第三章 合成漆酶的液体培养条件的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.2.1 菌种的产酶培养基
• 1.2.2 种子培养基
• 1.2.3 菌株产酶筛选培养基（基础培养基）
• 1.2.4 液体产酶发酵培养基
• 1.3 菌种培养方法
• 1.4 漆酶活力测定
• 1.5 菌体干重测定
• 2 结果与分析
• 2.1 合成漆酶的营养条件
• 2.1.1 碳源对漆酶合成的影响
• 2.1.2 氮源对漆酶合成的影响
• 2.2 不同天数的菌种对漆酶活力的影响
• 2.3 合成漆酶的工艺条件
• 2.3.1 温度对合成漆酶的影响
• 2.3.2 装液量对产酶活力的影响
• 2.3.3 摇床转数对产酶活力的影响
• 2.3.4 静止培养与摇床培养对产酶活力的影响
• 2.4 最适产酶发酵培养基的优化
• 2.4.1 均匀设计的试验安排及试验结果
• 2.4.2 产酶发酵培养基的二步寻优
• 2.5 某些化合物对漆酶合成的影响
• 2.6 菌株的产酶历程
• 第四章 漆酶的分离纯化及部分酶学性质的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 主要试剂与仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 粗酶液制备
• 1.3.2 酶液的浓缩
• 1.3.3 漆酶的沉淀分离
• 1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.3.5 漆酶活力测定
• 1.4 结果与分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历