论文摘要
目的:施万细胞（Schwann cell,SCs）是周围神经的主要结构和功能细胞,是周围神经系统特有的一种胶质细胞,在神经损伤后的再生和功能恢复中起着重要的作用。长期以来,周围神经病变严重影响着人们的生活质量,是神经科学研究领域中的一个复杂但十分重要的病变过程。近年来的研究发现,其发病机理之一是氧化应激引起氧自由基增多,从而导致了Schwann细胞的凋亡。Schwann细胞能够包绕轴突形成有髓纤维或无髓纤维,并分泌多种神经因子参与神经系统的发育和损伤后的再生。因此,越来越多的研究通过施加外界因素（如各种神经生长因子、中药、电磁场、硅胶管及其他移植物等）干预Schwann细胞的生存环境,探讨能够促进周围神经损伤后的再生过程的适宜方法。目前,应用神经营养因子促进神经系统生长发育的研究已经得到人们广泛的认可。胰岛素样生长因子—1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）是一种肽能神经生长因子,与组织分化、增殖和成熟密切相关。IGF-1具有非选择性神经营养作用,能促进外周神经再生。体外研究发现,IGF-1对各种中枢神经细胞均有神经营养和保护作用,能够影响神经细胞的生长、存活和分化。同时,大量实验证实,IGF-1对多种刺激因素（如缺血、缺氧,氧化应激等）引起的细胞凋亡有抑制作用。IGF-1的抗氧化作用已有初步研究,但对周围神经中Schwann细胞氧化损伤的保护作用的机理尚未见报道。本课题通过建立过氧化氢诱导的Schwann细胞氧化损伤模型,并在此模型的基础上,观察了神经因子IGF-1对氧化损伤的Schwann细胞的保护作用,通过MTT、生化检测、吖叮橙染色、Western blot等方法进行细胞活力测定、酶活力分析、凋亡率的分析以及凋亡蛋白Bcl-2表达水平的测定,探讨IGF-1抗氧化损伤、抗凋亡的作用机理,为揭示IGF-1治疗周围神经病变的机制提供理论依据。方法:本课题从新生一周内Wistar大鼠的坐骨神经和臂丛神经获取Schwann细胞,用含10%胎牛血清（FCS）的DMEM/F12培养液于5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。Schwann细胞培养72小时后,分为3个实验组,另设一空白对照组。1.大体观察在加入H2O2损伤因素与IGF-1保护因素后12h时,倒置相差显微镜下观察Schwann细胞的大体形态、贴壁数量和生长状态等情况,并照相记录。2.Schwann细胞的纯化及鉴定利用传代法纯化Schwann细胞。实验前Schwann细胞爬片作S-100免疫组化染色,鉴定Schwann细胞。3.实验分组将培养细胞分为3组:①过氧化氢损伤组:在培养基中加入终浓度为100μmol/L的H2O2;②IGF-1保护组:100μmol/L的H2O2+100ng/ml的IGF-1;③正常组（不加任何因素）;同时设立仅加培养液的空白对照组。4.MTT法进行胰岛素样生长因子-1（IGF-1）抗过氧化氢氧化损伤的作用分析。5.生化检测细胞内脂质过氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD的水平。6.应用吖叮橙荧光染色观察、比较过氧化氢损伤组、IGF-1保护组和正常对照组细胞的存活、凋亡情况。7.正常对照组、过氧化氢损伤组和IGF-1保护组细胞提取总蛋白,通过SDS-PAGE及蛋白印迹（Western blot）检测凋亡蛋白Bcl-2的表达水平变化情况。通过以上的实验,建立了过氧化氢诱导Schwann细胞的氧化损伤模型,在此模型的基础上探讨IGF-1对Schwann细胞抗氧化损伤、抗凋亡的作用机理。结果:刚接种的原代Schwann细胞呈圆形,悬浮在培养液中,接种6h后大部分细胞贴壁,部分细胞开始呈椭圆形,24h后变成双极,胞体饱满,立体感强,少数呈三角形,伸出三个突起。培养48～72h后,出现聚合现象,许多细胞聚合在一起,呈端对端、肩并肩、漩涡状或栅栏状排列,在细胞密度较低时,则聚集成堆,形成“细胞岛”,免疫细胞化学染色为S-100阳性;另一种细胞稍大,外形不规则,呈扁平状,突起短而多,核较浅,为成纤维细胞,所占比例较低。培养72小时后进行传代、纯化Schwann细胞,镜下观察Schwann细胞的纯度明显增加,免疫化学染色显示80%以上的细胞S-100呈阳性反应。加入H2O2 12小时后,在倒置显微镜下观察发现细胞的形态发生改变,细胞突起萎缩,胞体肿胀变圆、空泡化变,细胞数量减少,部分细胞脱壁,漂浮于培养液中,胞体立体感差,折光度下降,并可见大量细胞碎片;IGF-1保护组的细胞生长状态良好,突起伸展,细胞存活数量多,胞体较饱满、立体感较强,少见细胞皱缩破碎现象,但细胞聚团现象较明显;正常组的细胞胞体梭形、折光度好,突起较长,细胞数量明显较多,偶有漂浮死细胞。不同实验组检测结果如下:1.MTT法检测IGF-1抗氧化损伤的作用分析表明:IGF-1可明显拮抗过氧化氢诱导的氧化损伤,与过氧化氢损伤组相比,IGF-1保护组可维持较高的细胞存活率,二者之间有统计学意义（P＜0.05）。同时,IGF-1保护组的细胞存活率低于正常组,二者之间亦有统计学意义。2.生化指标SOD检测结果表明:与过氧化氢损伤组相比,IGF-1保护组细胞内超氧化物歧化酶（SOD）维持在较高的活力水平,表明IGF-1可明显拮抗过氧化氢引起的SOD降低;同时低于正常对照组,有统计学意义（P＜0.05）。3.生化指标MDA检测结果表明:与正常组相比,过氧化氢引起细胞内脂质过氧化物的大量堆积,即MDA含量增加;而IGF-1可明显降低细胞内脂质过氧化物的含量（P＜0.05）。4.吖叮橙荧光染色法在荧光显微镜下观察到,发生凋亡的阳性细胞呈圆形,体积明显缩小,细胞核内可见致密浓染的黄色荧光和凋亡小体,胞质为火焰样橘红色荧光;正常组的Schwann细胞呈梭形,胞核圆形、椭圆形,呈亮绿色,胞质为灰绿色和橙红色,亦可见少量的凋亡前期细胞。损伤组细胞量明显减少,凋亡形态典型;保护组存活细胞量增多,细胞状态明显好转。5.蛋白印迹Western blot显示抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况:过氧化氢损伤组细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下调,而加入IGF-1保护后Bcl-2蛋白表达上调（P＜0.05）,正常组的蛋白表达量最高。结论:我们以原代培养的Schwann细胞为实验材料,利用过氧化氢诱导Schwann细胞建立氧化损伤模型,在此基础上,观察过氧化氢诱导Schwann细胞的氧化损伤作用及神经因子IGF-1对氧化损伤的Schwann细胞的保护作用。实验结果显示:过氧化氢损伤能够引起细胞内自由基的增多,SOD活力的降低,脂质过氧化物的增多,并且自由基的增多能通过信号通路上抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达而最终引起细胞的凋亡;IGF-1不仅能降低细胞内脂质过氧化物（MDA）的含量,维持细胞内超氧化物歧化酶（SOD）的含量,还能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制细胞死亡的发生,证明IGF-1可以明显拮抗过氧化氢对Schwann细胞的氧化损伤作用。本研究探讨了IGF-1对Schwann细胞氧化损伤的保护作用,从氧化损伤信号转导通路方面探讨了IGF-1的抗氧化、抗凋亡作用的分子机制,为研究周围神经病变中自由基的分子作用机制以及IGF-1等神经营养因子在在周围神经病变中的治疗作用提供了一定的理论依据。
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