猪群中猪圆环病毒带毒情况的调查及猪圆环病毒1型荧光定量PCR方法的建立

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2, PCV2）是引起猪断奶后系统衰竭综合征等相关疾病的重要病原之一。ORF2基因不仅是PCV1和PCV2主要结构蛋白的编码基因,而且也是区分PCV1和PCV2的重要区域,其编码蛋白具有良好的抗原性,本研究利用PCR技术扩增出PCV1株ORF2基因,进行分子克隆,成功建立了PCV1荧光定量PCR检测方法。采用套式PCR技术对2006年高热病地区和华南地区规模化猪场发病猪群与死亡猪群进行PCV1与PCV2检测,完成了13株PCV2分离毒株的全基因组与11株PCV1分离毒株的全基因组序列测定与分析。1采用套式PCR方法对华南地区的规模化养猪场或个体养殖户送检的144份猪血清进行了猪圆环病毒1型（PCV1）与猪圆环病毒2型（PCV2）病毒检测。PCV1阳性率为14.6%,PCV2阳性率为27.8%;PCV1与PCV2均为阳性的阳性率为4.9%。采用套式PCR方法对2006年高热病地区采集98份猪的病料进行了猪圆环病毒1型（PCV1）与猪圆环病毒2型（PCV2）病毒检测。PCV2总阳性率达到79.6%,PCV1总阳性率为7%;检测结果表明此次高热病猪圆环病毒二型感染相当严重。2从发病猪组织中分离出13株PCV2,11株PCV1并全部进行了全基因组序列测定,结果表明,11株PCV1分离株的基因组全长均为1759 bp,与国、内外分离毒株的全基因组序列比较发现发生的变异很小。13株PCV2分离株的基因组全长均为1767 bp,与国、内外分离毒株的全基因组序列比较发现,5株华南地区PCV2分离株变异很小,8株高热病地区PCV2分离株发生了很大的变异。3根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型（PCV1）ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1 ORF2基因进行PCR扩增,构建重组质粒pMD-ORF2作为标准阳性模板。同时根据测完序的PCV1 ORF2基因序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针。通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PCV1检测的荧光定量PCR方法,对阳性组织病料的检测表明该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR（nPCR）具有相近的灵敏度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 PCV 的概况
• 1.2 猪圆环病毒的研究进展
• 1.2.1 猪圆环病毒的发现和命名
• 1.2.2 猪圆环病毒的病毒学分类地位
• 1.2.3 猪圆环病毒全球的流行和分布状况
• 1.2.4 猪圆环病毒的形态学特性
• 1.2.5 猪圆环病毒的特性
• 1.2.6 猪圆环病毒的基因组
• 1.2.7 猪圆环病毒的复制与转录
• 1.2.8 猪圆环病毒编码蛋白的研究
• 1.2.9 猪Ⅱ型圆环病毒引起的疾病及其致病机理
• 1.2.10 组织病理学研究
• 1.2.11 猪圆环病毒感染的诊断
• 1.2.12 猪圆环病毒感染的防制
• 1.3 论文设计思路及技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种、质粒和细胞系
• 2.2 试验方法
• 2.3 主要仪器
• 2.4 方法
• 2.4.1 PCV1 与 PCV2 的检测
• 2.4.2 PCV1 与 PCV2 的全基因以及PCV1-ORF2 基因的克隆
• 2.4.3 PCV1 荧光定量PCR 方法的建立
• 3 结果与分析
• 3.1 PCV1 与 PCV2 的检测及鉴定
• 3.1.1 PCV1 与 PCV2 的鉴定
• 3.1.2 PCV1 与 PCV2 的检测
• 3.2 PCV1 与 PCV2 的全基因的克隆与序列分析
• 3.2.1 PCV1 的全基因的克隆与序列分析
• 3.2.2 PCV2 的全基因的克隆与序列分析
• 3.3 PCV1-ORF2 基因的克隆
• 3.3.1 ORF2 基因的 PCR 扩增
• 3.3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.3.3 PCV1 ORF2 基因编码的蛋白结构功能分析
• 3.4 PCV1 荧光定量 PCR 方法的建立
• 3.4.1 引物、探针浓度及循环条件
• 3.4.2 标准曲线及 FQ-PCR 灵敏度
• 3.4.3 FQ-PCR 的特异性
• 3.4.4 FQ-PCR 的准确性和重复性
• 3.4.5 FQ-PCR 与常规 PCR、套式 PCR 检测比较
• 4 结果讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介