人乙酰化酶和去乙酰化酶研究体系的建立及对两个新乙酰化酶的克隆、表达、纯化和功能研究

论文摘要

包括人类基因组在内的近一百个物种的基因组测序已经基本完成。如何利用这些基因组的数据,对蛋白进行大规模的研究,已经成为现代生物学所面临的一个巨大挑战。目前蛋白质组学的主要研究内容和方法主要有对于蛋白表达谱的研究、对于蛋白的细胞内定位研究、对于蛋白间相互作用和信号途径建立的研究以及对于蛋白的生物学功能的研究。 乙酰化酶和去乙酰化酶在生命活动过程中起着重要作用。目前对于乙酰化酶和去乙酰化酶的研究还基本上是传统的单个蛋白的研究方法。利用基因组的数据,系统化地研究乙酰化酶和去乙酰化酶,一方面可以扩展对乙酰化酶和去乙酰化酶功能的了解,另一方面如果能成功地系统化地进行乙酰化酶和去乙酰化酶的研究,完全可以扩大到激酶和酯酶等其它较大的蛋白家族或超家族的研究。 GNAT家族是蛋白乙酰化酶中极为重要的一个家族。研究表明,该家族的乙酰化酶参与了细胞生长调控、基因转录激活和DNA损伤修复。 本研究在对人类乙酰化酶和去乙酰化酶的研究过程中,得到了以下结果: 1、通过搜索比对等生物信息学方法系统地归纳和整理了人类乙酰化酶和去乙酰化酶,并构建了它们的系统发生树,为进一步研究功能打下了基础。 2、建立起一个快速、高效地研究人类乙酰化酶和去乙酰化酶的平台。 3、在对乙酰化酶GNAT家族进行研究分析的过程中,找到一个人GNAT家族的新成员MAK3。MAK3含有一个保守的乙酰化酶结构域,并且不同物种中的MAK3蛋白序列高度保守。我们通过半定量和定量RT-PCR检测了在不同组织中MAK3的mRNA水平。并且把MAK3分别克隆到了真核和原核表达质粒中,通过免疫印迹技术证实了MAK3蛋白的表达。我们还进一步用亲和层析的方法成功纯化了细菌中表达的MAK3蛋白,并对纯化后的MAK3蛋白的酶活性进行了测定。这些研究结果为进一步深入研究MAK3的生物功能打下了基础。 4、在对乙酰化酶GNAT家族进行研究分析的过程中,找到另一个人GNAT家族的新成员FLJ13848。FLJ13848含有一个保守的乙酰化酶结构域,并且不同物种中的FLJ13848蛋白序列高度保守。我们把FLJ13848分别克隆到了真核和原核表达质粒中,通过免疫印迹技术证实了FLJ13848蛋白的表达。并且用免疫染色的方法观察到了FLJ13848在真核细胞内的定位。我们还进一步用亲和层析的方法成功纯化了细菌中表达的FLJ13848蛋白,并对纯化后的FLJ13848蛋白的酶活性进行了测定。另外,FLJ13848对转录因子AP-1的激活作用同时被检测到。这些研究结果为进一步深入研究FLJ13848的生物功能打下了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.文献综述
• 1.1 人类基因组计划
• 1.1.1 由来与现状
• 1.1.2 模式生物基因组研究
• 1.1.3 EST战略
• 1.2 后基因组时代与功能基因组学
• 1.2.1 后基因组时代
• 1.2.2 功能基因组学
• 1.3 生物信息学
• 1.3.1 从计算生物学到生物信息学
• 1.3.2 生物信息学三大组成部分
• 1.3.3 后基因组时代的生物信息学
• 1.4 蛋白质组学
• 1.4.1 对于蛋白表达谱的研究
• 1.4.2 对于蛋白的细胞内定位研究
• 1.4.3 对于蛋白间相互作用和信号途径建立的研究
• 1.4.4 对于蛋白的生物学功能的研究
• 1.5 组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶
• 1.5.1 组蛋白乙酰化酶及其复合体
• 1.5.2 组蛋白去乙酰化酶及其复合体
• 2.开题设想
• 3.材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 生物信息学分析
• 3.1.2 生物化学、细胞生物学与分子生物学实验
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 乙酰化酶和去乙酰化酶系统发生树（phylogenetic tree）的建立
• 3.2.2 生物信息学分析MAK3和FLJ13848
• 3.2.3 MAK3和FLJ13848克隆
• 3.2.4 MAK3和FLJ13848在真核细胞中的表达和分析
• 3.2.5 MAK3和FLJ13848在细菌中的表达和纯化
• 3.2.6 MAK3的组织分布分析
• 3.2.7 FLJ13848在真核细胞中的共定位
• 3.2.8 FLJ13848和MAK3乙酰化酶活性测定
• 3.2.9 FLJ13848对转录因子AP-1的激活作用
• 4.结果分析
• 4.1 人类乙酰化酶和去乙酰化酶生物信息的数据挖掘
• 4.2 人类乙酰化酶和去乙酰化酶系统发生树的构建
• 4.3 MAK3的发现及其序列分析
• 4.4 MAK3在HEK293T细胞中的表达
• 4.5 MAK3在大肠杆菌中的表达及纯化
• 4.6 MAK3乙酰化酶活性测定
• 4.7 MAK3的组织分布
• 4.8 FLJ13848的发现及其序列分析
• 4.9 FLJ13848在HEK293T细胞中的表达
• 4.10 FLJ13848在真核细胞中的共定位
• 4.11 FLJ13848在大肠杆菌中的表达及纯化
• 4.12 FLJ13848乙酰化酶活性测定
• 4.13 FLJ13848对转录因子AP-1的激活作用
• 5.讨论
• 5.1 关于构建含Myc标签（Myc Tag）的所有乙酰化酶和去乙酰化酶的表达质粒
• 5.1.1 cDNA的制备
• 5.1.2 基因克隆体系的选择和建立
• 5.1.3 蛋白在细胞中的表达检测
• 5.2 高通量研究乙酰化酶和去乙酰化酶的一些生物功能
• 5.2.1 荧光素酶报告基因检测
• 5.2.2 其它一些生物指标
• 5.3 深入研究一些有作用的乙酰化酶和去乙酰化酶的作用的分子机制
• 5.3.1 对一些可能的分子机制作直接的研究和分析
• 5.3.2 没有明确的候选分子机制情况下的pull down和质谱分析
• 5.4 关于MAK3的研究
• 5.5 关于FLJ13848的研究
• 参考文献
• 致谢
• 研究生学习期间的科研成果