PPARα基因V227A变异在肝细胞中的生物学作用及其机制研究

论文摘要

背景与目的：过氧化物酶体增殖物激活受体属于核受体超家族的成员,在非酒精性脂肪性肝病的发病机制中发挥了重要的作用。我们前期研究发现：PPARαV227A基因型分布在非酒精性脂肪性肝病和健康人群中存在差异,且PPARα基因227A携带者（突变型）体重、体重指数、臀围、腰围、腰臀比、体脂含量、腹壁脂肪厚度明显低于非227A携带者（野生型）,因此推测PPARα基因227A携带者（突变型）对肥胖的发病可能是一保护性因素。为进一步探索PPARα基因V227A变异的生物学功能,本研究拟构建PPARαV227A野生型和突变型的真核表达载体,并转染L02肝细胞株,建立稳定表达PPARα-EGFP融合蛋白的细胞模型；探讨PPARαV227A变异在肝细胞中的生物学作用及其相关机制。方法：设计带有突变碱基的引物,通过融合PCR引入突变碱基,获取PPARαV227和227A的全长基因,再将野生型和突变型的PPARα基因插入真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1-PPARαV227A重组质粒。经测序验证、确定所扩增的DNA序列为PPARα基因。以脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N1-PPARαV227、pEGFP-N1-PPARα227A和空质粒pEGFP-N1分别转染L02肝细胞株,经G418筛选出阳性克隆,用荧光倒置显微镜、Western blOt证实PPARα-EGFP融合蛋白在L02肝细胞中的表达。并将L02肝细胞分成四组：pEGFP-N1-PPARαV227组（野生组）、pEGFP-N1-PPARα227A组（突变组）pEGFP-N1组（空载体组）和对照组；每组再分为PPARα激动剂WY14643干预组和WY14643不干预组,分别采用MTT技术检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡,并用Western blOt检测PPARα作用相关通路蛋白及信号分子的表达变化。结果：（1）成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N1-PPARαV227（野生型）和pEGFP-N1-PPARα227A（突变型）；（2）获得了稳定表达PPARαV227-EGFP（野生型）和PPARα227A-EGFP（突变型）融合蛋白的L02细胞株；（3） MTT结果显示：野生组细胞生长较为缓慢,与突变组细胞相比,野生组细胞存活率明显降低（P<0.01）。（4）流式细胞术Annexin V与PI双染色结果显示：野生组细胞凋亡率较高,与突变组细胞相比,野生组细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。（5） Western blot结果显示：野生组和突变组肝细胞PPARα、RXRα蛋白的表达无明显差异；PPARα激动剂WY14643可诱导PPARα、RXRα蛋白的表达；（6）突变组肝细胞p44/42MAPK （Thr202/Tyr204）磷酸化蛋白的表达水平明显高于野生组；NF-KB-p65 （Ser536）磷酸化蛋白的表达水平低于野生组。结论：（1）构建了重组真核表达载体pEGFP-N1-PPARαV227（野生型）和pEGFP-N1-PPARα227A （突变型）；（2）获得了稳定表达PPARαV227-EGFP （野生型）和PPARα227A-EGFP（突变型）融合蛋白的L02细胞株；（3） PPARα227A （突变型）细胞存活率高于PPARαV227 （野生型）,而凋亡率低于PPARαV227（野生型）；（4） PPARα227A（突变型）可能较PPARαV227 （野生型）有更高的活性,并可能通过增加P44/42MAPK （Thr202/Tyr204）磷酸化蛋白的表达及抑制NF-κB-p65 （Ser536）磷酸化蛋白的表达而影响L02细胞的增殖与凋亡。该研究结果为PPARαV227A变异在肝细胞中的生物学作用提供了重要的参考价值,但是PPARαV227A野生型和突变型在细胞或机体内具体如何发挥作用仍不明确,有待于在今后的研究工作中做深入的探索。

论文目录

• 致谢
• 序言
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 插图和附表清单
• 目次
• 1 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究内容
• 2 pEGFP-N1-PPARα V227A真核表达载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 小结
• 3 pEGFP-N1-PPARα V227A真核表达载体转染L02胞
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 小结
• 4 PPARα基因V227A变异对肝细胞增殖与凋亡的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 小结
• 5 PPARα基因V227A变异影响肝细胞增殖与凋亡的机制研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 小结
• 6 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在学期间主持课题和发表论文