小麦盐诱导表达TaWRKY79、TaWRKY80转录因子基因的克隆及功能分析

论文摘要

干旱、高盐和低温等非生物逆境严重影响了植物的生长发育和限制作物的产量。在逆境胁迫条件下，植物首先要通过多种途径感应环境的变化，然后将环境变化转变为细胞内部的信号，在接受了细胞的内部信号后，转录因子等反式作用因子与顺式作用元件结合来启动抗逆基因的表达，从而提高植物的抗逆性。许多植物逆境胁迫诱导基因的表达都在转录水平上受转录因子和顺式作用成分的调控，因此转录因子也在植物逆境信号传递过程中起着中心调节的作用。本文克隆了普通小麦的2个盐诱导表达的WRKY转录因子基因，分别命名为TaWRKY79、TaWRKY80以及TaWRKY79的启动子序列。序列分析表明，TaWRKY79基因编码328个氨基酸；TaWRKY80基因编码458个氨基酸；蛋白质保守结构域分析表明2个基因都含有一个WRKY保守结构域，属于ClassⅡ WRKY转录因子家族。在洋葱表皮细胞内瞬时表达实验证明，TaWRKY79与GFP的融合蛋白聚集在细胞核内，表明该基因编码一种核蛋白。同时，我们克隆了TaWRKY79基因的启动子区域，并克隆到含有GUS报告基因的载体上转化拟南芥植株，得到的转基因株系经高盐、ABA、冷处理等处理后，GUS组织化学检测结果显示TaWRKY79基因的启动子被盐、ABA、冷诱导后增强表达。RT-PCR分析表明TaWRKY79、TaWRKY80在小麦的根和叶中组成型表达，且受PEG、高盐和低温胁迫的诱导表达。表明这两个基因可能会在小麦对逆境胁迫响应中发挥一定作用。为了研究所克隆基因的生物学功能，通过农杆菌介导法分别获得了上述2个基因的超表达转基因拟南芥株系。结果发现：过表达TaWRKY79、TaWRKY80的转基因拟南芥植株对ABA的敏感性降低，且TaWRKY79的转基因植株提高了对干旱、高盐胁迫的耐受能力，并使转基因植株中AAB1、ICE1、ABA2、ABI1的基因上调表达；超表达TaWRKY80的转基因植株也提高了抗干旱和高盐的能力，同时使转基因植株中ABI5、SOS1、ABI1、ABI2、ICE1、DREB、RD19A基因上调表达；另外，对2个基因的转基因株系进行生理指标测定，结果显示在转基因株系中脯氨酸的含量明显高于野生型。总之，小麦TaWRKY79、TaWRKY80基因编码具有调节功能的蛋白，并受逆境胁迫因子PEG、高盐、低温的诱导，可能在小麦的生长、发育及逆境胁迫应答信号传导途径中发挥重要的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 土地的退化与作物产量
• 1.2 非生物胁迫对植物的影响
• 1.2.1 盐胁迫对植物生长发育的影响
• 1.2.2 旱胁迫对植物生长发育的影响
• 1.3 植物转录因子
• 1.3.1 转录因子的结构
• 1.3.1.1 DNA 结合域
• 1.3.1.2 转录调节域
• 1.3.1.3 寡聚化位点
• 1.3.1.4 核定位信号区
• 1.3.2 转录因子的功能
• 1.3.2.1 调控生长发育
• 1.3.2.2 调控植物抗病性
• 1.3.2.3 调控植物抗逆性
• 1.3.3 转录因子结构特性的研究方法
• 1.3.3.1 DNA 结合域的研究
• 1.3.3.2 转录调控区的研究
• 1.3.3.3 核定位信号区的鉴定
• 1.3.4 植物转录因子功能的研究方法
• 1.3.4.1 植物转录因子的瞬时表达分析
• 1.3.4.2 利用突变体和转基因植株分析转录因子的功能
• 1.4 植物 WRKY 转录因子的研究进展
• 1.4.1 WRKY 基因的结构及分类
• 1.4.2 WRKY 蛋白与 W-box 的结合
• 1.4.3 WRKY 基因的起源与分子进化
• 1.4.4 WRKY 蛋白的生物学功能
• 1.4.4.1 WRKY 转录因子植物生物胁迫及其信号转导过程中的调控作用
• 1.4.4.2 WRKY 转录因子在植物非生物胁迫及其信号转导过程的调控作用
• 1.4.4.3 WRKY 转录因子在植物形态建成及生长发育中的作用
• 1.4.4.4 WRKY 转录因子在植物代谢中的调节作用
• 1.4.4.5 小结
• 1.5 本论文立题依据及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶与各种生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 TOTAL RNA 提取
• 2.2.2 RNA 反转录及第一链 CDNA 合成
• 2.2.3 小麦 TAWRKY79 基因的 PCR 扩增
• 2.2.4 小麦 TAWRKY80 基因的 PCR 扩增
• 2.2.5 扩增产物的电泳纯化与回收
• 2.2.6 回收片段的连接
• 2.2.7 回收片段的克隆测序
• 2.2.7.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7.2 连接产物的转化
• 2.2.7.3 重组质粒的鉴定
• 2.2.8 小麦基因组 DNA 提取
• 2.2.9 不同胁迫条件下的诱导表达
• 2.2.10 亚细胞定位分析
• 2.2.10.1 瞬时表达融合基因载体的构建
• 2.2.10.2 基因枪法介导的基因瞬时表达
• 2.2.11 转化拟南芥的研究
• 2.2.11.1 植物表达双元载体构建
• 2.2.11.2 拟南芥转化
• 2.2.11.3 阳性植株筛
• 2.2.11.4 转基因植株的抗性鉴定
• 2.2.11.5 转基因植株生理指标的测定
• 2.2.12 TaWRKY79 基因启动子的克隆
• 2.2.12.1 小麦 TaWRKY79 基因启动子的 PCR 扩增
• 2.2.12.2 PCR 产物的回收克隆与测序
• 2.2.12.3 小麦 TaWRKY79 基因启动子转化拟南芥的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 TaWRKY79 基因的克隆和鉴定
• 3.1.1 TaWRKY79 基因的克隆和序列分析
• 3.1.2 小麦 TaWRKY79 基因在不同胁迫条件下的表达分析
• 3.1.3 TaWRKY79 基因的亚细胞定位
• 3.1.3.1 TAWRKY79 瞬时表达载体构建
• 3.1.3.2 TAWRKY79 亚细胞定位
• 3.1.4 TaWRKY79 基因转化拟南芥
• 3.1.4.0 植物双元过表达载体的构建
• 3.1.4.1 植物双元过表达载体的农杆菌转化
• 3.1.4.2 转基因拟南芥的鉴定
• 3.1.4.3 转基因拟南芥的表型分析
• 3.1.4.3.1 转基因拟南芥的表型
• 3.1.4.3.2 过表达 TAWRKY79 的转基因拟南芥抗旱性分析
• 3.1.5 TaWRKY79 转基因株系中逆境相关基因的表达分析
• 3.1.6 转基因植株中脯氨酸含量的测定
• 3.1.7 TAWRKY79 基因启动子的克隆与分析
• 3.1.8 TaWRKY79 基因启动子的活性鉴定
• 3.1.8.1 植物双元过表达载体的构建
• 3.1.8.2 植物双元过表达载体的农杆菌转化
• 3.1.8.3 WP-GUS 重组体的拟南芥转化及筛选
• 3.1.8.4 启动子活性分析
• 3.2 TaWRKY80 基因的克隆和鉴定
• 3.2.1 TaWRKY80 基因的克隆和序列分析
• 3.2.2 TaWRKY80 基因的生物信息学分析
• 3.2.3 小麦 TaWRKY80 基因在不同胁迫条件下的表达分析
• 3.2.3.1 ABA 处理条件下 TaWRKY80 基因的表达分析
• 3.2.3.2 PEG 处理条件下 TaWRKY80 基因的表达分析
• 3.2.3.3 NaCl 处理条件下 TaWRKY80 基因的表达分析
• 3.2.4 TaWRKY80 基因的转化拟南芥分析
• 3.2.4.0 植物双元过表达载体的构建
• 3.2.4.1 植物双元过表达载体的农杆菌转化
• 3.2.4.2 转基因拟南芥的鉴定
• 3.2.4.3 转基因拟南芥的表型及抗逆性分析
• 3.2.4.3.1 转基因拟南芥的表型分析
• 3.2.4.3.2 转基因拟南芥的抗旱性分析
• 3.2.4.4 相关 MAKER 基因在转基因植株的上调表达分析
• 3.2.4.5 脯氨酸含量的测定
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况