应用免疫磁珠法分离提纯雪旺细胞及其增殖的实验研究

论文摘要

雪旺细胞（Schwann cells,SCs）是周围神经系统的主要胶质细胞,在周围神经损伤修复中起决定性作用,它能分泌多种神经营养因子促进神经轴突的发芽再生;为再生轴突的延伸和生长提供隧道。所以,目前认为雪旺细胞在周围神经损伤修复及神经组织工程中有良好的应用前景。在体外培养中,成纤维细胞的增殖速度远远快于雪旺细胞,使雪旺细胞的分离和提纯因成纤维细胞的污染而变得困难。因此如何快速获取大量、高纯度、高活性雪旺细胞目前仍是制约雪旺细胞移植的关键。本实验的目的是通过免疫磁珠法分离及提纯雪旺细胞,并配置一种能够使雪旺细胞快速增殖的培养液配方。实验一应用免疫磁珠法分离及提纯雪旺细胞选用4～7d SD大鼠,无菌条件下取双侧坐骨神经,长约1cm,解剖镜下显微剥离去除神经外膜,获得神经束。将神经束剪碎至约1mm3大小颗粒。采用双酶二次消化法消化,加入胎牛血清中止消化后,离心并加入DF12培养液培养。7d后应用免疫磁珠法对细胞进行纯化培养,培养2d后进行传代接种。培养过程中对细胞进行形态学观察,计数及活力测定;MTT法绘制细胞生长曲线,采用免疫细胞化学荧光染色对细胞进行鉴定并且计算所得细胞纯度。结果:经S-100及免疫荧光鉴定所得细胞为雪旺细胞;采用免疫磁珠法能对培养所得雪旺细胞进行纯化。纯化后雪旺细胞活力为96%,纯度98%,培养2d后就可以传代。结论:免疫磁珠法可以用于雪旺细胞的纯化培养,所得雪旺细胞纯度高,活力强,能满足组织工程人工神经的需要。实验二雪旺细胞增殖的实验研究取生长良好的第二代雪旺细胞,经消化制成单细胞悬液,接种于96孔培养板,接种密度为1×104/ml,每块6×12孔,200ul/孔,共接种9个样本。实验分成6组（每组12孔）:A组为空白对照组（基础培养液）;B组为含50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor bFGF）培养液组;C组为含50ng/ml硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparin sulfate proteoglycan protein,HSPG）培养液组;D组为含100ng/ml HSPG细胞培养液组;E组为含50ng/mlbFGF +50ng/ml HSPG细胞培养液组;F组为含50ng/ml bFGF +100ng/mlHSPG细胞培养液组。37oC,5%CO2培养,每日固定时间取板1块（每间隔24h取板1块）,酶联免疫检测仪测吸光度值（A值/OD值）,激发波长:490nm,计算当日各组A值均数,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制生长曲线。结果:B、C、D、E、F组均优于对照组,有统计学意义（P<0.05）;B、C、D组没有明显差别,无统计学意义（P>0.05）;E、F组均优于B、C、D组,有统计学意义（P<0.05）;E、F组没有明显差别,无统计学意义（P>0.05）。结论:用含bFGF + HSPG细胞培养液能够使雪旺细胞快速增殖;含50ng/mlbFGF +100ng/ml HSPG细胞培养液（F组）生长最旺盛,E、F组第9天到分裂顶峰期;A、B、C、D第7天到分裂顶峰期。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一应用免疫磁珠法分离提纯雪旺细胞
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 细胞分离
• 2.2 细胞纯化
• 2.3 细胞计数
• 2.4 MTT 法绘制雪旺细胞生长曲线
• 2.5 细胞鉴定
• 2.6 细胞纯度
• 3 结果
• 3.1 雪旺细胞的形态学鉴定
• 3.2 雪旺细胞鉴定
• 3.3 雪旺细胞增殖能力测试
• 4 讨论
• 实验二 雪旺细胞增殖的实验研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 配置培养液
• 2.2 MTT 比色试验
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 雪旺细胞观察
• 3.2 MTT 法检测各组不同时间的A 值
• 3.3 绘制细胞生长曲线
• 3.4 统计结果分析
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢