基质金属蛋白酶-26在非小细胞肺癌中的表达、临床意义及调控机制

论文摘要

肺癌是当前人类发病率最高的恶性肿瘤,肺癌的侵袭与转移是其恶性标志和特征,也是造成病人死亡的主要原因。而基底膜和细胞外基质（主要成分是IV型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等）的降解和破坏是肿瘤转移多阶段过程中的重要步骤。多种蛋白酶家族如基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等可能促进各种肿瘤的侵袭转移,基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是其中最主要的酶家族。MMPs是一组金属离子锌依赖的、能降解细胞外基质的高度保守蛋白水解酶家族,迄今为止,人类中已识别和定性的有23种。根据作用底物的特异性,MMPs家族可分为胶原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18）,明胶酶（MMP-2、MMP-9）,间质溶解素（MMP-3、MMP-10、MMP-11）、基质溶解因子（MMP-7、-26）,膜接合型（MT）-MMPs （MMP-14、-15、-16、-24、MMP-17、-25）和其他型（MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27、-28）。基质金属蛋白酶-26（MMP-26） ,又称基质溶解因子-2（matrilysin-2或endometase） ,是MMPs家族基质溶解因子亚组的新成员,新近从人子宫内膜癌细胞系cDNA文库克隆,呈现一系列不同于MMPs家族其它成员的结构和功能特性。MMP-26可有效裂解纤维蛋白原和ECM蛋白,包括纤维连接蛋白、玻璃体结合蛋白、变性胶原、α1-抗胰蛋白酶,表明其在肿瘤侵袭和血管发生方面有重要而独特的功能。目前已有研究表明, MMP-26在正常组织的表达具有组织特异性,MMP-26在不同癌的表达趋势不同,而已有的研究表明肿瘤相关因子刺激下可促进MMP-26、TIMP-4转录激活,因而我们推测p38MAPK、ERK与MMP-26之间可能存在相互作用。关于MMP-26在癌侵袭转移的可能机制,现有几个研究发现MMP-26可能主要是通过激活MMP-9,改变TIMP-4表达等促进癌细胞的侵袭能力。目前关于MMP-26有限的研究主要集中在前列腺、子宫、乳腺、食管癌,然而不同癌结果相异,作用机制也不很清楚,尚无MMP-26与肺癌相关性的系统研究。本研究拟探讨:1、MMP-26在非小细胞肺癌组织的表达与临床病理相关性;2、MAPK信号通路阻滞剂对肺癌细胞MMP-26蛋白表达的影响;3、肺癌细胞转染含MMP-26cDNA质粒及针对MMP-26mRNA的干扰质粒shRNA后MMP-26、MMP-9、TIMP-4基因、蛋白、细胞侵袭能力变化及MMP-26、MMP-9在细胞内定位情况。通过上述多个层面研究,探讨MMP-26在肺癌发生发展中的作用机制以及作为靶点进行干预的可能性。实验分三部分:第一部分:MMP-26蛋白在非小细胞肺癌的表达及意义目的:检测MMP-26蛋白在侵润性非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）、侵润前肺癌和正常肺组织中的表达,探讨MMP-26在NSCLC发生发展中的作用及与预后的关系。方法:采用免疫组织化学（SP）法,分别检测72例NSCLC、14例非典型增生和10例正常肺组织中MMP-26蛋白的表达。结果:正常肺组织MMP-26蛋白高表达率0（0/10）,非典型增生高表达率14.3%（2/14）, NSCLC高表达率59.7﹪（43/72）。MMP-26蛋白在NSCLC中的表达高于非典型增生及正常肺组织（P<0.01）,非典型增生MMP-26蛋白表达高于正常肺组织表达,但二者差异无显著性（P >0.05）。MMP-26蛋白表达与分期（P<0.05）和淋巴结转移有关（P<0.05）,而与患者年龄、性别以及肿瘤大小、分化无关（均为P >0.05）。Cox比例风险模型进行多因素生存分析显示:MMP-26与临床分期是有意义的预后指标（P<0.05）。MMP-26蛋白高表达的NSCLC患者无复发生存期和总生存期低于阴性表达的患者（分别为log-rank=19.34、23.2,P<0.001、0.001 ）。结论:MMP-26蛋白高表达与NSCLC发生、淋巴结转移、临床分期及预后有关,有可能作为判断NSCLC进展和预测预后的一种指标。第二部分:ERK信号通路与MMP-26在肺腺癌表达的关系目的:研究细胞外信号调节激酶（extracelluar signal-regulated kinase ,ERK）通路与基质金属蛋白酶-26（matrix metalloproteinase-26,MMP-26）在肺腺癌表达的相关性及意义。方法:应用免疫组织化学（SP）法检测pERK、pp38MAPK及MMP-26在44例肺腺癌组织中的表达。Western blot检测U0126阻断ERK信号通路后肺腺癌A549细胞MMP-26蛋白表达水平的变化。分析pERK和MMP-26表达与肺腺癌预后的关系。结果:pERK、pp38MAPK及MMP-26蛋白在肺腺癌组织中高表达率分别为59.1%、20.4%、54.5%,pERK与MMP-26表达存在正相关（r=0.63,P<0.05）,并与肺腺癌的临床分期及淋巴转移状况相关（P<0.05）,而与患者年龄、肿瘤大小无明显相关性（P>0.05）。pp38MAPK与MMP-26、患者年龄、淋巴转移、肿瘤大小、临床分期均无明显相关性（P>0.05）。用ERK阻断剂U0126阻断ERK信号通路可降低MMP-26蛋白表达水平,并且随U0126浓度升高MMP-26蛋白表达水平逐渐降低。肺腺癌组织pERK、MMP-26蛋白的表达与肿瘤的预后显著相关（分别为log-rank=5.52、7.01,P=0.019、0.008）。结论:ERK信号通路可能通过上调MMP-26的表达促进肺腺癌的恶性进展, ERK信号通路可能是肺腺癌侵袭和转移的重要途径,pERK和MMP-26的表达可辅助用于肺腺癌的预后评估,为ERK信号通路作为肺腺癌治疗的靶点提供理论依据。第三部分:MMP-26 cDNA表达质粒和针对MMP-26 mRNA的shRNA干扰质粒的构建及其对肺癌细胞生物学特性的影响目的:构建含MMP-26 cDNA的表达质粒,构建含针对MMP-26 mRNA的shRNA干扰质粒,观察转染上述质粒对细胞生物学特性的影响。方法:构建含MMP-26 cDNA的表达质粒,转染到MMP-26低表达的95-C细胞,并筛选稳定表达的含MMP-26 cDNA的细胞,Western blot检测MMP-26、MMP-9、TIMP-4蛋白表达,RT-PCR检测MMP-26mRNA、MMP-9mRNA、TIMP-4mRNA表达,明胶酶谱分析检测过表达MMP-26对95-C分泌MMP-9的影响,Transwell试验检测细胞体外侵袭力,双荧光免疫细胞化学染色检测MMP-26、MMP-9蛋白在细胞内定位。构建含针对MMP-26 mRNA的shRNA干扰质粒,转染高表达MMP-26的A549细胞,并筛选稳定表达的含MMP-26 shRNA的细胞,Western blot检测MMP-26、MMP-9、TIMP-4蛋白表达,RT-PCR检测MMP-26mRNA、MMP-9mRNA、TIMP-4 mRNA表达,明胶酶谱分析检测过表达MMP-26对A549细胞分泌MMP-9的影响, Transwell试验检测细胞体外侵袭力。结果:转染含MMP-26 cDNA表达质粒的95-C细胞MMP-26、MMP-9蛋白表达上调（ p<0.05 ）, TIMP-4下调（ p<0.05 ）; MMP-26mRNA、MMP-9mRNA表达上调（p<0.05）,TIMP-4mRNA表达下调p<0.05)。明胶酶谱分析显示过表达MMP-26的95-C分泌MMP-9能力明显增强（p<0.05）,体外侵袭力增强（p<0.05）,双荧光免疫细胞化学染色发现MMP-26、MMP-9在细胞内共定位。转染针对MMP-26 mRNA的shRNA干扰质粒的A549细胞MMP-26、MMP-9蛋白表达下调（ p<0.05 ）, TIMP-4蛋白上调（ p<0.05 ）,MMP-26mRNA、MMP-9mRNA表达下调（p<0.05）,TIMP-4 mRNA上调（p<0.05）,分泌MMP-9能力明显下降（p<0.05）,体外侵袭力减弱（p<0.05）。结论:MMP-26可以促进肺癌细胞的侵袭,可能部分通过调节MMP-9、TIMP-4表达促进肺癌细胞的侵袭,MMP-26有望成为肺癌干预的靶点。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：基质金属蛋白酶-26 在非小细胞肺癌中的表达、临床意义及调控机制
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 MMP-26 蛋白在非小细胞肺癌的表达及意义
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分ERK 通路与MMP-26 在肺腺癌表达的相关性
• 前言
• 1 材料方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 MMP-26 cDNA 表达质粒和针对MMP-26 m RNA 的shRNA 干扰质粒的构建及其对肺癌细胞生物学特性的影响
• 前言
• MMP-26 cDNA 表达质粒构建及对肺癌生物学特性的影响
• 1 材料方法
• 2 结果
• 针对MMP-26 m RNA 的shRNA 干扰质粒的构建及其对肺癌细胞生物学特性的影响
• 1 材料方法
• 2 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 攻读博士学位期间参加的学术会议
• 攻读博士学位期间所获荣誉