探针法荧光定量PCR检测钩端螺旋体方法的建立

论文摘要

目的通过水解探针法（TaqMan技术）建立一种高敏、特异、简便、快速的荧光定量PCR方法（Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR）检测钩端螺旋体,并在SmartCycler、LightCycler2.0和ABI7300等3个不同厂家仪器上对检测方法进行评估。方法以编码钩端螺旋体（CMCC 56601株）外膜脂蛋白L32（Outer-membrane lipoprotein L32,LipL32）的lipL32基因为靶基因设计引物和探针,提取细菌基因组DNA（gDNA）,扩增出DNA目的片段并与pMD18-T vector连接并转化到大肠杆菌（E.coli Competent Cells）中,构建含有目的基因序列的质粒作为标准模板,通过直接PCR及DNA片段测序鉴定其正确性,并用BamH I限制酶进行线性化处理。用TaqMan标记探针和Cepheid公司的SmartCycler系统进行实时聚合酶链反应,建立钩端螺旋体快速检测方法。对FQ-PCR反应体系进行优化,确定最佳的引物和探针浓度。评价该检测方法的特异性、敏感性、进行模拟样本检测。分别在LightCycler2.0,ABI7300仪器上对检测方法进行评估。结果特异性:选取35株标准菌株验证本检测方法的特异性,结果证实目的菌基因有特异性扩增,而其他细菌均无扩增,即没有扩增信号出现,显示体系特异性是100%;灵敏度:该定量PCR在检测钩端螺旋体质粒标准品时的检测敏感度为10拷贝（copies）,检测钩端螺旋体gDNA的检测敏感度为10 fg,菌落培养最低能检测到2×10 cfu/ml,检测模拟水样本敏感度达2×102cfu/ml。建立的工作参考物线性质粒标准曲线Ct值与模板拷贝数对数呈良好的线性关系（相关系数≥0.995）,曲线斜率接近于理论值-3.32,斜率得出的PCR扩增效率E≥90%。在LightCycler2.0和ABI7300两款荧光FQ-PCR仪上对建立的体系进行评估验证,结果显示所建立的FQ-PCR检测方法在这两个型号仪器能得到相似的结果。结论本研究建立了钩端螺旋体快速FQ-PCR检测方法,该技术具有快速、灵敏、特异等特点,能够应用于不同型号的仪器。在公共卫生监控、疫情监测、流行病学调查、临床诊断等方面具有广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语表
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 附录
• 一、文献综述
• 参考文献
• 二、在学期间科研成绩
• 三、致谢
• 四、个人简介