木瓜凝乳蛋白酶的化学修饰研究

论文题目: 木瓜凝乳蛋白酶的化学修饰研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 舒薇

导师: 郭勇

关键词: 木瓜凝乳蛋白酶,单甲氧基聚乙二醇,化学修饰,检测分析

文献来源: 华南理工大学

发表年度: 2005

论文摘要: 木瓜凝乳蛋白酶（Chymopapain，EC3.4.22.6，Cp）是木瓜乳中含量最高、水解和凝乳活性最强的一种巯基蛋白酶。该酶除了在食品工业具有广泛的应用外，还具有非常重要的医药价值，其中以注射治疗椎间盘突出症的临床应用最为确切和成功。然而由于该酶体内半衰期短且易引发免疫反应而降低了该酶的临床应用效果。为此，作者开展了木瓜凝乳蛋白酶的化学修饰研究。本研究首先从商品木瓜蛋白酶粗品中分离纯化出木瓜凝乳蛋白酶纯品，再用活化的无免疫原性的单甲氧基聚乙二醇（mPEG-5000）为修饰剂，对Cp进行了共价修饰。通过实验筛选出最佳的修饰反应条件，进一步对修饰产物进行了检测与分析，并对Cp在修饰前后的主要酶学、药物生物学性质等进行了比较研究。 本研究以未激活的木瓜蛋白复合酶为上样酶液，以磷酸盐缓冲液为洗脱液进行离子强度和pH的线性双梯度洗脱。经CMC离子交换柱层析、超滤等纯化步骤，获得了产物均一、比活力为3389.1U／mg、酶活力回收率达68.9％、蛋白回收率达64.1％的Cp纯酶，经SDS-PAGE电泳检验达电泳纯。 在mPEG化学修饰的研究中，需对不同修饰产物的抗原性进行免疫学检测。抗原抗体的特异性结合是免疫学检测技术的基础，为此，开展了Cp多克隆抗体制备及分析、检测的研究。结果表明，抑活抗原比未处理原酶具有更好的免疫原性。以抑活的Cp为抗原，采用多次皮下注射和一次静脉冲击免疫相结合的方式制备出Cp抗体，经Western blotting法鉴定和ELISA法检测，其抗血清效价为106。同时，用ELISA法预先测定出用于各修饰酶抗原性检测的抗原、抗体的最佳工作浓度分别为1：400和1：500。 本研究制备出两种mPEG活化产物：mPEG1和mPEG2，这两种mPEG衍生物对蛋白酶的修饰效果不同。通过mPEG1、mPEG2对Cp修饰效果的比较得出，由于空间位阻效应较大，Cp经mPEG2修饰后对大分子底物的接近及催化能力明显减弱，因而在实际临床应用中不利于药效的发挥，因此，选用mPEG1为Cp的修饰剂。 通过实验，进一步筛选出mPEG1修饰Cp的最佳修饰反应条件：即在ATEE底物保护下，每10mg酶蛋白与0.8g mPEG1在pH值为9.0的硼酸缓冲液中4℃反应1h，可得抗原抗体结合力完全消失，而酶活力可达36％～40％的修饰酶。 毛细管电泳分析结果表明：在本研究筛选出的修饰反应条件下，mPEG1对Cp的共价修饰产物为多组分体系，最大产物峰为平均每分子Cp偶联3～4个mPEG1链的低修饰度产物峰。紫外吸收光谱和荧光发射光谱分析表明：该mPEG1

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 木瓜蛋白酶粗品及组成

1.2 木瓜凝乳蛋白酶

1.2.1 木瓜凝乳蛋白酶的命名与亚型

1.2.2 木瓜凝乳蛋白酶的立体结构

1.2.3 Cp抗原决定簇(表位)与IgE抗体

1.2.4 木瓜凝乳蛋白酶的理化性质

1.2.5 木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化

1.3 木瓜凝乳蛋白酶的应用

1.3.1 治疗腰椎间盘突出症

1.3.2 Rh血型鉴定

1.3.3 辅助治疗肿瘤

1.3.4 用于消炎和助消化

1.3.5 用于医学研究和分离细胞

1.4 免疫学、免疫检测技术概述

1.4.1 抗原与抗体

1.4.2 多克隆抗体制备

1.4.3 免疫检测方法概述

1.5 酶分子的化学修饰

1.5.1 化学修饰及药用酶蛋白化学修饰的意义

1.5.2 化学修饰使酶蛋白改性的原理

1.5.3 PEG化学修饰的方法

1.5.4 修饰效果的分析与评价

1.5.5 国内外研究现状

1.6 本课题的研究背景及研究意义

1.7 本课题的主要研究内容

第二章 木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 木瓜蛋白酶粗粉

2.2.2 主要试剂

2.2.3 常用试剂配制

2.2.4 主要仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 木瓜凝乳蛋白酶水解活力测定

2.3.2 木瓜凝乳蛋白酶凝乳活力的测定

2.3.3 蛋白质含量的测定

2.3.4 激活酶液和未激活酶液SDS-PAGE电泳比较

2.3.5 Cp的分离纯化

2.3.6 超滤和冰冻干燥

2.3.7 SDS-PAGE电泳分析

2.4 结果与讨论

2.4.1 蛋白质浓度随时间的变化

2.4.2 SDS-PAGE电泳结果比较

2.4.3 木瓜凝乳蛋白酶的CMC分离纯化

2.4.4 Cp收集液的超滤及冰冻干燥

2.4.5 Cp的分离纯化结果

2.4.6 SDS-PAGE纯度鉴定

2.4.7 Cp的大量纯化及制备

2.5 本章小结

第三章 木瓜凝乳蛋白酶多克隆抗体的制备

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 木瓜凝乳蛋白酶(Cp)

3.2.2 实验动物

3.2.3 主要试剂

3.2.4 主要试剂配制

3.2.4 主要仪器和设备

3.3 实验方法

3.3.1 H_2O_2的可逆抑制作用

3.3.2 Cp的三种抗原形式

3.3.3 Cp多克隆抗血清制备

3.3.4 抗血清Western blotting法分析

3.3.5 抗血清效价检测—间接ELISA法

3.3.6 结果判定

3.3.7 数据处理

3.3.8 抗原抗体最适工作浓度的测定

3.4 结果与分析

3.4.1 H_2O_2的可逆抑制作用

3.4.2 抗血清的western blotting法鉴定及ELISA法测定

3.4.3 统计分析结果

3.4.4 抗原抗体最佳工作浓度的测定结果

3.5 本章小结

第四章 木瓜凝乳蛋白酶的mPEG化学修饰

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 木瓜凝乳蛋白酶(Cp)

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要试剂配制

4.2.4 主要仪器和设备

4.3 实验方法

4.3.1 活化修饰剂mPEG_1的制备

4.3.2 活化修饰剂mPEG_2的制备

4.3.3 活化mPEG_1对Cp的修饰(无保护下)

4.3.4 活化mPEG_1对Cp的修饰(ATEE底物保护下)

4.3.5 活化mPEG_2对Cp的修饰(无保护下)

4.3.6 活化mPEG_2对Cp的修饰(ATEE底物保护下)

4.3.7 酶活力的测定(以酪蛋白为底物)

4.3.8 酶活力的测定(以BAEE为底物)

4.3.9 氨基残留率(平均修饰度)测定

4.3.10 各修饰酶的抗原抗体结合力检测

4.3.11 pH值对mPEG_1化学修饰的影响

4.3.12 反应温度对mPEG_1化学修饰的影响

4.3.13 修饰时间对mPEG_1化学修饰的影响

4.4 结果与讨论

4.4.1 mPEG_1对Cp化学修饰效果的影响

4.4.2 mPEG_2对Cp化学修饰效果的影响

4.4.3 mPEG_1、mPEG_2对Cp化学修饰效果的比较与筛选

4.4.4 pH值对mPEG_1修饰效果的影响

4.4.5 反应温度对mPEG_1化学修饰的影响

4.4.6 修饰时间对mPEG_1化学修饰的影响

4.4.7 PEG化学修饰Cp的最佳修饰条件的优化

4.5 本章小结

第五章 木瓜凝乳蛋白酶mPEG_1修饰产物的检测与分析

5.1 前言

5.2 实验材料

5.2.1 木瓜凝乳蛋白酶mPEG_1修饰产物

5.2.2 主要试剂

5.2.3 主要试剂配制

5.2.4 主要仪器和设备

5.3 实验方法

5.3.1 修饰产物的毛细管电泳检测与分析

5.3.2 mPEG_1-Cp水解酶活力测定

5.3.3 平均修饰度测定

5.3.4 抗原抗体结合力测定

5.3.5 mPEG_1-Cp的紫外吸收光谱分析

5.3.6 mPEG_1-Cp荧光发射光谱分析

5.4 结果与分析

5.4.1 毛细管电泳对修饰产物组分及分子量的测定与分析

5.4.2 mPEG_1-Cp的平均修饰度、酶活力、免疫原性及体内活力半衰期的测定

5.4.3 紫外吸收光谱分析

5.4.4 荧光发射光谱分析

5.5 本章小结

第六章 mPEG_1-Cp部分酶学、药物生物学性质研究

6.1 前言

6.2 实验材料

6.2.1 酶

6.2.2 实验动物

6.2.3 主要试剂

6.2.4 主要试剂配制

6.2.5 主要仪器和设备

6.3 实验方法

6.3.1 酶水解活力测定(酪蛋白为底物,下同)

6.3.2 修饰酶的Km~(app)与原酶Km测定(酪蛋白为底物)

6.3.3 mPEG_1-Cp与Cp最适pH、pH稳定性比较

6.3.4 mPEG_1-Cp与Cp最适反应温度、热稳定性比较

6.3.5 mPEG_1-Cp与Cp抗胰蛋白酶水解能力的比较

6.3.6 mPEG_1-Cp与Cp体内活性半衰期比较(药代动力学)

6.3.7 mPEG_1-Cp与Cp等电点pI比较

6.4 结果与讨论

6.4.1 mPEG_1-Cp表观米氏常数Km~(app)、Cp米氏常数Km比较

6.4.2 mPEG_1-Cp与Cp最适pH及pH稳定性比较

6.4.3 mPEG_1-Cp与Cp最适温度及热稳定性比较

6.4.4 mPEG_1-Cp与Cp抗胰蛋白酶水解能力的比较

6.4.5 mPEG_1-Cp与Cp体内活性半衰期比较(药动学)

6.4.6 mPEG_1-Cp与Cp等电点pI值的测定

6.5 本章小结

结论与展望

参考文献

在学期间发表与学位论文内容相关的学术论文

致谢

发布时间: 2006-09-19

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