农田中洋葱伯克氏菌基因型及其与医院同类致病菌的比较研究

论文摘要

洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)是一种广泛存在于农业环境和医院的革兰氏阴性细菌,现被国际上划分为9个基因型,合称洋葱伯克氏菌群(B.cepacia complex,简称Bcc)。Bcc虽然引起洋葱酸皮病,但国内主要作为生物农药在应用。目前国内外报道该菌引起洋葱伯克氏综合症而致多人死亡。现有研究显示Bcc菌中生物农药菌、植物致病菌和人体条件致病菌难以区分。我国无人涉足Bcc菌基因型及其与医院致病菌的比较研究。我国农田中存在哪些Bcc基因型、它们是否与医院同类致病菌一样危险等问题急待解决。 本研究从广西、浙江、海南、河北4省共采集农田灌溉水和土壤样本43份,用选择培养基Bcc富集液分离Bcc菌株,经表型特征鉴定后确定所分离的细菌菌株中有26个为Bcc菌株。从辽宁、浙江2省的医院获取并用表型特征鉴定Bcc菌株41个。研究表明Biolog和脂肪酸分析(FAMEs)均只能将Bcc鉴定到种的水平,而无法鉴定到基因型。 由于各基因型Bcc菌株间同源性极高,常用的细菌分子鉴定手段16S rRNA基因序列比较无法区分各基因型。本研究采用recA基因区分Bcc各基因型菌株,同时比较了recA特异引物PCR扩增和recA全序列分析的方法与表型鉴定方法的差异,经表型鉴定方法定为Bcc的67个菌株中只有59个被确证为Bcc菌株,其中农田菌株25个,医院菌株34个,Biolog和FAMEs对Bcc菌的误鉴定率为11.94%。农田菌株中检测到基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ,其中基因型Ⅰ为优势类型,其次是基因型Ⅴ;医院菌株中检测到基因型Ⅰ、Ⅱ、ⅢA、ⅢD和Ⅴ,其中基因型ⅢA为优势类型,它是引起洋葱伯克氏综合症的主要基因型,但同时也发现医院存在较高比率的基因型Ⅰ菌。recA特异引物PCR扩增法是针对医院Bcc菌株的基因型鉴定设计的,该法操作简便、准确率较高可以作为初步鉴定Bcc基因型的主要手段,但是由于一些基因型recA特异引物的缺少(如基因型Ⅸ)和对农田菌株灵敏度不够高(如基因型Ⅱ),因此recA全序列分析是鉴定和确证Bcc基因型不可或缺的手段。研究还表明一些菌株的基因型与其在TSA平板上的菌落特征有一定的对应关系,通常基因型Ⅰ菌株菌落均为黄绿色、基因型Ⅳ菌落接近无色、基因型Ⅲ的菌落多为乳白色。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 与人体致病相关的生防菌
• 第二节 细菌鉴定技术的研究进展
• 第三节 Burkholderia cepacia分离及鉴定技术的研究进展
• 第四节 微生物农药的风险分析
• 第五节 洋葱伯克氏细菌是敌人还是朋友?
• 第二章 洋葱伯克氏群菌的分离及其表型鉴定
• 第三章 农田和医院Bcc菌株的基因型鉴定
• 第四章 Burkholderia cepacia基因型Ⅰ内农田和医院菌株的区分
• 第五章 Bcc菌对4种植物病原菌的拮抗性及其生物安全性评价
• 附录
• 附录1 博士期间论文发表情况
• 附录2 常用培养基及生理、生化试验试剂配方
• 附录3 分子生物学试验常用试剂及缓冲液配方