伪旋毛虫肌幼虫WR29抗原基因的克隆、表达及鉴定

论文摘要

旋毛虫可以感染包括人类在内几乎所有的哺乳动物,是宿主范围最为广泛的寄生虫之一,它所引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的、危害严重的人兽共患寄生虫病。由于旋毛虫抗原成分极其复杂,而且不能进行体外大量培养和繁殖,旋毛虫病免疫诊断及预防相对困难,通过构建旋毛虫不用时期的cDNA表达文库,并利用免疫学筛选方法获得了功能性抗原基因,对旋毛虫病的诊断和防治等具有重要意义。本研究利用分子生物学及免疫学技术,分离肌幼虫抗原基因,为旋毛虫病反应原性及特异性诊断抗原基因的筛选及大量制备奠定基础。将阳性克隆pBluescript-WR29进行测序,用分子生物学软件对所得cDNA序列进行分析。利用PCR技术,从筛选得到的pBluescript-WR29重组质粒中扩增到不含信号肽序列的WR29基因片段,克隆到pMD18-T载体,序列测定后重组到原核表达载体pET-28a中。将重组质粒pET-28a-WR29转入克隆菌DH5α和表达菌BL21（DE3）感受态细胞中,提取质粒进行PCR鉴定和测序鉴定。用IPTG诱导培养重组表达菌,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,经IPTG诱导后重组菌体裂解产物与对照菌相比出现了一条相对分子量约为27.9kDa的新条带,与重组蛋白的理论值相符,薄层扫描结果显示,在诱导4h时,表达量达到高峰,目的蛋白占菌体总蛋白的58.1%。以切胶纯化的WR29重组蛋白为抗原免疫VC獭兔,每二周免疫一次,共免疫5次,末次免疫后二周心脏采血取血清。检测血清效价。Western-blotting检测显示,重组抗原可被旋毛虫感染猪血清识别。设计WR29基因特异引物,利用RT-PCR技术,从提取的伪旋毛虫肌幼虫、新生幼虫、3日龄及5日龄成虫期总RNA中反转录WR29 cDNA,对RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示,此基因在伪旋毛虫肌幼虫、新生幼虫、3日龄及5日龄成虫期均有表达。本研究为进一步建立敏感、特异的旋毛虫病免疫学检测方法奠定基础。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写词表
• 前言
• 第一篇 文献综述旋毛虫分子生物学研究进展
• 1 旋毛虫种属分类的研究进展
• 1.1 分类现状
• 1.2 我国旋毛虫属的分类
• 2 旋毛虫分类的分子生物学技术研究进展
• 2.1 简单重复序列锚定PCR
• 2.2 限制性酶切片段长度多态性及核酸探针技术
• 2.3 随机扩增多态性DNA
• 2.4 PCR- 单链构象多态性分析
• 2.5 多重PCR （ multiplex PCR）
• 2.6 DNA 序列分析及分子系统发生研究
• 3 旋毛虫抗原的研究
• 3.1 旋毛虫表面抗原
• 3.2 虫体抗原
• 3.3 杆细胞颗粒相关抗原
• 3.4 旋毛虫排泄/分泌（Excretory-Secretory，ES）抗原
• 3.5 旋毛虫重组抗原
• 4 旋毛虫病的检测方法
• 4.1 检测病原
• 4.2 免疫学诊断
• 4.2.1 皮内试验
• 4.2.2 补体结合试验（CF）
• 4.2.3 凝集试验
• 4.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 4.2.5 免疫酶染色试验（IEST）
• 4.2.6 增强化学发光酶免疫染色试验（ECIA）
• 4.2.7 循环抗原的检测
• 4.2.8 聚醛化聚苯乙烯（ PAPS）免疫微球快速诊断法
• 4.2.9 免疫聚合酶链反应法（ Immuno-PCR）
• 4.3 Western 印迹技术
• 4.4 聚合酶链式反应（PCR）检测技术
• 第二篇 研究内容
• 第一章 伪旋毛虫肌幼虫WR29 抗原基因的序列分析及克隆
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 分析
• 1.2.2 pBluescript-WR29 目的片段PCR 扩增
• 1.2.3 pMD -WR29 克隆载体的构建
• 1.2.4 重组质粒pMD18T-WR29 的序列鉴定
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第二章 伪旋毛虫肌幼虫WR29 抗原基因重组表达载体的构建及高效表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组质粒pET-WR29 的构建
• 2.2.2 重组质粒的测序鉴定
• 2.2.3 重组蛋白的诱导表达
• 2.2.4 重组蛋白的表达量测定
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 伪旋毛虫肌幼虫WR29 抗原基因重组蛋白的鉴定及在不同发育时期的表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 兔抗WR29 重组蛋白抗血清的制备
• 3.1.4 Western blotting 检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 包涵体的纯化
• 3.2.2 血清效价的测定
• 3.2.3 Western blotting 检测结果
• 3.2.4 各组样品总RNA 纯度及完整性分析
• 3.2.5 WR29mRNA 检测情况
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 导师及作者简介
• 中文摘要
• ABSTRACT