论文摘要
目的:胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）诊断试剂盒目前在国际上只有美国、德国等几个国家生产,且价格及其昂贵,导致在国内临床上的应用大大受限。本实验室曾选用多种载体制备IGF-1蛋白抗原,但效果不理想,蛋白得率均比较低,给进一步制备IGF-1单克隆抗体及生产IGF-1诊断试剂盒带来困难。为填补国内IGF-1诊断试剂盒自主生产的空白,本实验室在既往实验研究的基础上,选用pET29a（+）、pET32a（+）载体,表达并纯化含有hIGF-1的重组蛋白,从而制备稳定分泌抗hIGF-1单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:1.采用PCR法,扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段,通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET29a（+）/hIGF-1、pET32a（+）/hIGF-1重组载体。2.分别将其转化入工程菌BL21（DE3）中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化。3.用免疫印迹（Westernblot）法检测重组蛋白的抗原活性。4.用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb。5.对mAb进行鉴定,包括用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）亚类等。结果:重组质粒pET29a（+）/hIGF-1、pET32a（+）/hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90%以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带,表明重组蛋白具有免疫学特异性。经免疫小鼠、细胞融合后获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合。腹水mAb效价可达6×104。mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol。2株单抗属IgM亚类。染色体分析符合杂交瘤细胞特征。结论:高效表达具有免疫学特性的hIGF-1前体蛋白,成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件。
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标签：人胰岛素样生长因子论文; 单克隆抗体论文; 重组蛋白论文;