几种禾本科牧草遗传转化体系的建立和抗虫转基因研究

论文摘要

牧草是草食动物的主要饲料来源，也是发展畜牧业的前提。但近年来，由于草地退化和荒漠化，再加上蝗灾的危害，致使川西北草地的生态环境更为恶化，严重的影响了我国西部地区畜牧业的发展。由于蝗虫有迁徙性行为，因此蝗虫的防治难度大、化学防治成本高、效果差，并且存在食品安全性和生态安全性等问题。选育抗蝗虫牧草品种是蝗虫防治的根本途径，但却面临育种周期长和抗蝗虫品种资源严重匮乏的限制。利用基因工程技术将杀虫蛋白基因通过遗传转化创建牧草抗蝗虫新材料，具有周期相对较短和不受生殖障碍限制等优点，是抗蝗虫牧草品种遗传改良的一个重要方向。 本研究以川草二号老芒麦(Elymus sibiricus L．)和短芒披碱草(Elymus breviaristatus)的愈伤组织为受体材料，通过根癌农杆菌介导，将来自于类产碱假单胞菌的杀虫蛋白基因转入到受体材料的基因组中，从而培育出具有抗蝗虫特性的转基因牧草新材料。获得的主要研究结果如下： 一)．类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(ppip)的功能研究 1．类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(ppip)在大肠杆菌中的表达 由于大肠杆菌的启动子不能识别类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(ppip)，因此ppip基因不能直接在大肠杆菌细胞中表达。本研究利用来自大肠杆菌的

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• 缩写词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 禾本科牧草的组培再生体系及转基因技术的研究进展
• 1.禾本科牧草的组培再生
• 1.1 愈伤组织的形态发生方式
• 1.1.1 不定芽方式
• 1.1.2 胚状体方式
• 1.2 影响禾本科牧草再生的因素
• 1.2.1 植物激素对牧草愈伤组织诱导的影响
• 1.2.2 植物激素对牧草愈伤组织分化的影晌
• 1.2.3 受体材料和外植体来源对牧草愈伤组织再生的影响
• 1.2.4 继代培养时间对牧草愈伤组织分化能力的影晌
• 1.2.5 其他因素对牧草愈伤组织诱导和再生的影响
• 2.禾本科牧草的遗传转化
• 2.1 禾本科牧草遗传转化的方法
• 2.1.1 根癌农杆菌介导的遗传转化
• 2.1.2 通过原生质体的遗传转化
• 2.1.3 脂质体介导转化法
• 2.1.4 电击穿孔转化法
• 2.1.5 PEG介导转化法
• 2.1.6 农杆菌共培养转化法
• 2.1.7 基因直接转入组织细胞
• 2.2 影响禾本科牧草的遗传转化的因素
• 2.2.1 农杆菌菌株
• 2.2.2 乙酰丁香酮
• 2.2.3 单糖
• 2.2.4 甜菜碱
• 2.2.5 钙离子
• 2.2.6 共培养时间
• 2.2.7 渗透处理
• 2.2.8 外植体的类型和生理状态
• 2.2.9 外植体的预培养
• 2.3 转化细胞的选择培养和高频再生
• 2.3.1 转化细胞的选择
• 2.3.2 高效转化体再生
• 2.4 转基因表达和转基因沉默
• 2.4.1 外源基因整合和表达
• 2.4.2 转基因沉默
• 2.4.3 消除转基因沉默的方法
• 参考文献
• 第二章 类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因在大肠杆菌中的表达和鉴定
• 摘要
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 仪器和设备
• 1.1.3 试剂盒及购买的试剂
• 1.1.4 自配的主要试剂和培养基
• 1.1.5 引物序列
• 1.2 方法
• 1.2.1 类产碱假单胞菌总DNA提取
• 1.2.2 质粒大批量提取
• 1.2.3 质粒小批量提取
• 1.2.4 引物设计
• 1.2.5 PCR克隆
• 1.2.6 PCR产物连接到pMD18—T载体
• 1.2.7 大肠杆菌高频转化法
• 1.2.8 大肠杆菌氯化钙转化法
• 1.2.9 重组质粒的酶切和目标片段的回收
• 1.2.10 基因工程质粒的构建
• 1.2.11 DNA测序
• 1.2.12 DNA序列分析
• 1.2.13 ppip基因的表达及其杀虫蛋白的检测
• 1.2.14 室内的蝗虫喂饲实验
• 2.结果
• 2.1 杀虫蛋白基因的序列测定及分析
• 2.2 pLQZ、pppip、pLppip和pLTppip载体的构建
• 2.3 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.4 室内的蝗虫喂饲实验
• 3.讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三章 ppip基因植物表达载体的构建和在烟草中表达的研究
• 摘要
• 引言
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 仪器和设备
• 1.1.4 试剂盒和购买的试剂
• 1.1.5 自配的主要试剂
• 1.1.6 植物培养基
• 1.1.7 引物序列
• 1.2 方法
• 1.2.1 表达载体pCppip的构建
• 1.2.2 重组载体转化大肠杆菌
• 1.2.3 目的基因的植物表达载体转化根癌农杆菌
• 1.2.4 农杆菌介导的植物表达载体pCppip叶盘法转化烟草
• 1.2.5 再生植株的PCR检测
• 1.2.6 转基因植株的Southern杂交分析
• 1.2.7 室内的蝗虫喂饲实验
• 2.结果
• 2.1 目的基因植物表达载体pCppip的构建
• 2.2 ppip基因转化烟草的结果
• 2.2.1 叶盘法转化烟草
• 2.2.2 诱导丛生芽
• 2.2.3 诱导生根
• 2.2.4 移栽
• 2.2.5 再生植株的PCR检测
• 2.2.6 Southern杂交
• 2.3 转基因植株的抗虫性实验
• 3、讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四章 农杆菌介导的川草二号老芒麦高效转基因体系的建立
• 摘要
• 引言
• 1. 材料及方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 外植体
• 1.1.2 仪器和设备
• 1.1.3 菌株、质粒和工具酶
• 1.1.4 自配的主要标准试剂
• 1.1.5 自配的其它试剂
• 1.1.6 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 川草二号老芒麦愈伤组织再生体系的建立
• 1.2.2 根癌农杆菌介导川草二号老芒麦愈伤组织遗传转化体系的建立
• 1.2.3 转化植物的分子检测
• 2 结果
• 2.1 川草二号老芒麦愈伤组织再生体系的建立
• 2.1.1 不同基本培养基和外植体材料对老芒麦愈伤组织诱导频率的影响
• 2.1.2 NAA,6-BA,KT,ABA,CH等植物生长调节物质对老芒麦愈伤组织诱导的影响
• 2.1.3 不同植物生长调节剂组合对以川草二号老芒麦成熟胚为外植体的愈伤组织诱导频率的影响
• 2.1.4 光照对老芒麦愈伤组织诱导频率的影响
• 2.1.5 不同培养基对不同老芒麦品种愈伤组织分化频率的影响
• 2.1.6 不同继代培养时间对愈伤组织分化能力的影响
• 2.1.7 不同的植物生长调节剂组合对川草二号老芒麦愈伤组织分化的影响
• 2.1.8 川草二号老芒麦愈伤组织再生图片
• 2.2 类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因转化载体的构建
• 2.3 程序化转基因体系的建立
• 2.3.1 潮霉素（Hn）有效筛选浓度的试验
• 2.3.2 愈伤组织继代时间与农杆菌侵染
• 2.3.3 共培养温度与农杆菌侵染
• 2.3.4 不同培养培养基与农杆菌侵染
• 2.3.5 农杆菌处理菌液浓度与其侵染
• 2.4 转化植物的分子检测
• 2.4.1 转化植株的DNA抽提
• 2.4.2 转基因植株的PCR鉴定
• 2.4.3 转基因植株Southern杂交分析
• 2.4.4 转基因植株的RT-PCR分析
• 2.4.5 转基因植株的抗虫性实验
• 2.4.6 农杆菌介导的川草二号老芒麦转基因操作体系及体系效率的验证
• 2.4.7 转基因川草二号老芒麦的再生图
• 3、讨论
• 3.1 川革二号老芒麦愈伤组织再生体系
• 3.2 禾本科牧草的遗传转化
• 小结
• 参考文献
• 第五章 根癌农杆菌介导ppip基因转化短芒披碱草的研究
• 摘要
• 引言
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 外植体
• 1.1.2 仪器和设备
• 1.1.3 菌株、质粒和工具酶
• 1.1.4 自配的主要标准试剂
• 1.1.5 自配的其它试剂
• 1.1.6 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 短芒披碱草愈伤组织再生体系的建立
• 1.2.2 根癌农杆菌介导的短芒披碱草愈伤组织遗传转化体系的建立
• 1.2.3 转化植物的分子检测
• 1.2.4 室内的蝗虫喂饲实验
• 2 结果
• 2.1 短芒披碱草愈伤组织再生体系
• 2.1.1 诱导愈伤组织的基本培养基和外植体的筛选
• 2.1.2 植物生长调节剂及其组合对愈伤组织诱导的影响
• 2.1.3 不同培养基和继代时间对愈伤组织分化的影响
• 2.1.4 植物生长调节剂组合及浓度对短芒披碱草愈伤组织分化的影响
• 2.1.5 短芒披碱草愈伤组织再生体系
• 2.2 类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因转化载体的构建
• 2.3 程序化转基因体系的建立
• 2.4 转化植物的分子检测
• 2.4.1 转化植株的DNA抽提
• 2.4.2 转基因植株的PCR鉴定
• 2.4.3 转基因植株Southern杂交分析
• 2.4.4 转基因植株的RT-PCR分析
• 2.5 转基因植株的抗虫性实验
• 2.6 农杆菌介导的短芒披碱草转基因操作体系及体系效率的验证
• 2.7 转基因短芒披碱草的再生图片
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 在校期间发表文章情况
• 致谢