论文摘要
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种感染偶蹄类动物的传染性疾病。口蹄疫的暴发对于动物的健康造成严重的威胁,大量动物死亡以及因口蹄疫而引起的贸易壁垒给其他无疫情国家经济带来了沉重的打击。目前还没有消灭口蹄疫的国家,疫苗在疾病控制中起到了主要的作用。虽然灭活病毒疫苗能够有效预防口蹄疫,但其应用还伴随着残留的危险问题,包括病毒灭活不完全、病毒在疫苗生产设备中的逃逸等。为此,基因工程疫苗就成为了克服病毒灭活苗缺点的候选。口蹄疫是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒引起的。病毒颗粒由60个亚单位组成,每个亚单位包含各一分子的VP1,VP2,VP3和VP4,这4个分子组成了病毒壳蛋白P1,P1包含病毒衣壳表面的几乎所有的抗原表位。FMDV的主要中和性抗原表位位于VP1的G-H环,目前研究中发现应用含有该位点的基因工程疫苗,虽然诱导产生较高的抗体水平但是对动物的保护率并不能达到理想的水平。提示其它表位在抗FMDV免疫中同样起到重要作用,如果将P1蛋白作为疫苗抗原将起到更好的免疫效果。同时P1蛋白在形成VP1,VP2,VP3和VP4的过程中需要3C蛋白酶的作用,因此在本研究中,将P1和3C蛋白共同作为疫苗的抗原,同时通过密码子优化的方式以求达到获得高效FMD基因工程疫苗的目的。研究中人工合成了密码子优化的P12A3C序列,利用over-lapping PCR技术扩增获得P12A3C的全长基因,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建了重组穿梭质粒pAdTrack-P12A3C与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,利用细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy-P12A3C;转染293细胞以包装、扩增重组腺病毒AdP12A3C,并用同样的方法制备对照空载腺病毒Adeasy。通过PCR、RT-PCR、ELISA鉴定重组腺病毒P12A3C基因的体外转录和表达情况。此外研究中还构建了重组DNA疫苗质粒pcP12A3C。将上述基因工程疫苗免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、液相阻断法、中和试验检测疫苗的特异性体液免疫应答反应;通过细胞因子分泌、淋巴细胞增殖试验、CTL活性测定检测疫苗的特异性细胞免疫应答反应。结果发现构建成功的DNA疫苗重组质粒pcP12A3C和重组腺病毒AdP12A3C,体外感染细胞中能有效表达P12A3C基因。用疫苗pcP12A3C和AdP12A3C免疫小鼠后可刺激机体持续产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,其中,AdP12A3C诱导的中和性抗体水平达到1:32以上,达到有效的中和抗体水平。而DNA疫苗pcP12A3C虽然诱导了中和性抗体的产生但效价较低。DNA疫苗和重组腺病毒疫苗都诱导产生Th1型的细胞免疫反应,免疫小鼠可诱生出病毒特异性的CTL活性,杀伤靶细胞。结论表达P12A3C抗原的重组腺病毒载体疫苗能够诱导机体产生有效的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有成为FMD疫苗的发展潜力。DNA疫苗的研发工作一直是我室的研究重点,并且随着DNA疫苗的发现以及其在预防感染性疾病中的广泛应用已经被誉为医学的巨大成功和发展。DNA疫苗作为生物医药产品应用的质量控制是一个亟待解决的问题。目前,已发现残留工程菌的基因组DNA是一种潜在的危险因素,因此其含量水平必须控制在容许的范围内。研究中我们报告了斑点杂交的方法检测纯化DNA疫苗产品中残留宿主细胞DNA水平。本方法应用了PCR扩增的地高辛标记的大肠杆菌16S rRNA基因为探针。这种斑点杂交方法应用大肠杆菌16S rRNA基因为探针,其灵敏度强于单拷贝的UidR基因探针。优化的斑点杂交法同时具有低背景和灵敏度较高（10 pg残留E.coli DNA）的特点。本方法适合常规应用检测药学级别DNA疫苗中残留E.coli DNA水平。