香蕉镰刀菌枯萎病抗病种质RGAs的克隆与分析

论文摘要

香蕉镰刀菌枯萎病,又称巴拿马病,是一种由土壤真菌引起的毁灭性病害,目前正严重危害世界香蕉生产。从抗镰刀菌枯萎病种质材料中分离出抗镰刀菌枯萎病基因,为抗病育种服务,已成为业内研究的热点和难点问题。同源序列候选基因法已成为克隆抗病基因的一条新途径,也是较快捷且较有效的方法,即利用已知植物抗病基因保守结构域的特性,设计简并引物,从植物抗病种质中获得其抗病基因同源序列（Resistance gene analog sequences,RGAs）。利用这些RGAs可以进一步分析筛选候选抗病基因,并制作探针来定位、克隆抗病基因,也可以用来设计特异性引物,应用于分子标记辅助选择育种,同时对于研究抗病基因的起源和进化关系也有重要意义。本研究以此为基础,从抗镰刀菌枯萎病香蕉种质ROSE和GCTCV-119的基因组DNA和cDNA中分离RGAs,获得的主要研究结果如下:1.基于其它植物抗病基因NBS类保守域设计简并引物,从抗镰刀菌枯萎病香蕉种质GCTCV-119中分离了19个RGA片段,大小为520bp左右,其中9条DNA片段和10条cDNA片段,根据其推断的氨基酸序列,经保守结构域分析,其结构域均为NB-ARC,均属于NBS类候选抗病基因类序列,具有P-loop（Kinase-la）,Kinase-2,RNBS-B（Kinase-3a）以及疏水氨基酸结构域GLPL等保守氨基酸序列。其保守氨基酸基元分别是P-loop（GMGGVGKTT）,Kinase-2（LLVLDDIW）,RNBS-B（CKVLFTTRS）,GLPL（GLPLALKVL）。将获得的19条RGA片段分别命名为BR-1,BR-2,……,BR-19,并提交GenBank,获得登录号分别为EF515833-EF515836,EU123871-EU123885;2.利用其他植物PK类抗病基因的9个结构域设计简并引物,从抗镰刀菌枯萎病香蕉种质ROSE和GCTCV-119中分离了20个香蕉RGAs片段,大小为530bp左右,其中14条DNA片段和6条cDNA片段。根据其推断的氨基酸序列,经保守结构域分析,其结构域为S TKc,为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,包含4功能域,分别为ATP binding pocket,substrate binding pocket,catalytic loop和activation loop。具有9个高度保守的氨基酸区域:Ⅰ.FG（K/V/L/S）VY-（K/R）G;Ⅱ.VAVK;Ⅲ.FxxE;Ⅳ.（L/V/I）Vx（I/V/L）;V.ALV;Ⅵ.D（L/I/V）K;Ⅶ.DFG;Ⅷ.G（T/S）xGY（L/I/A）PE;Ⅸ.D（Y/I）YS（F/Y）G（V/I/M）。将这20条RGA序列分别命名为Mu-PK1,Mu-PK2,……,Mu-PK20,并提交GenBank,获得登录号分别为EU293391-EU293404（DNA片段）,EU338457-EU338462（cDNA片段）;3.根据已获得香蕉RGA序列,设计7对NBS类特异引物和2对PK类特异引物,在37份香蕉种质中扩增,扩增结果无明显差异;选取6份抗镰刀菌枯萎病香蕉种质和5份感病种质,进一步进行PCR-RFLP分析,结果发现只有Mu-NBS5/HaeⅢ标记能够把11份香蕉的基因型区分开来。4.为进一步了解镰刀菌枯萎病香蕉抗病种质与感病种质在RGA上的差异,选用3对NBS类特异引物和1对PK类特异引物对11份香蕉种质基因组PCR扩增后测序,发现香蕉种质之间存在许多限制性内切酶位点的差异及单核苷酸多态性的变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 植物抗病基因研究进展
• 1.3 果树抗病基因研究进展
• 1.4 植物抗病基因产物的结构特征
• 1.4.1 核苷酸结合位点（NBS）
• 1.4.2 富亮氨酸重复序列（LRRs）
• 1.4.3 丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶（STK）
• 1.4.4 亮氨酸拉链（LZ）
• 1.4.5 果蝇Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体（TIR）
• 1.5 本研究的内容及目的
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 研究目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试验设备
• 2.1.3 试验试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 香蕉基因组DNA的提取
• 2.2.2 香蕉总RNA的提取
• 2.2.3 简并引物设计
• 2.2.4 简并引物对香蕉基因组DNA的扩增
• 2.2.5 简并引物对香蕉cDNA的扩增
• 2.2.6 特异引物对香蕉基因组DNA的PCR扩增
• 2.2.7 PCR/RT-PCR扩增产物的回收与纯化
• 2.2.8 大肠杆菌化学法感受态细胞的制备
• 2.2.9 回收产物的T-A克隆
• 2.2.10 质粒DNA的提取
• 2.2.11 阳性克隆检测
• 2.2.12 测序与序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 香蕉基因组DNA电泳检测
• 3.2 香蕉叶片总RNA的提取
• 3.3 香蕉NBS类候选抗病基因的克隆及序列分析
• 3.3.1 香蕉NBS类候选抗病基因的基因组片段扩增
• 3.3.2 香蕉NBS类候选抗病基因cDNA片段扩增
• 3.3.3 香蕉NBS类候选抗病基因克隆
• 3.3.4 香蕉NBS类候选抗病基因序列分析
• 3.3.5 香蕉NBS类候选抗病基因系统进化分析
• 3.3.6 香蕉NBS类相关基因的特异性扩增及PCR-RFLP分析
• 3.3.7 香蕉NBS类候选抗病相关基因的序列差异分析
• 3.4 香蕉PK类候选抗病基因的克隆及序列分析
• 3.4.1 香蕉PK类候选抗病基因的基因组片段的克隆
• 3.4.2 香蕉PK类候选抗病基因的cDNA片段的克隆
• 3.4.3 香蕉PK类候选抗病基因的克隆
• 3.4.4 香蕉PK类候选抗病基因的序列分析
• 3.4.5 香蕉PK类候选抗病基因系统进化分析
• 3.4.6 香蕉PK类候选抗病相关基因的序列差异分析
• 4 讨论
• 4.1 香蕉RGAs序列克隆的简并引物筛选
• 4.2 香蕉抗病种质中RGAs的序列特征
• 4.3 集群分离分析在香蕉抗病基因分子标记筛选上的应用
• 4.4 香蕉RGAs限制性内切酶位点差异与单核苷酸多态性
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士研究生期间发表的论文
• 附录1 香蕉NBS类RGAs核苷酸序列及氨基酸序列
• 附录2 香蕉PK类RGAs核苷酸序列及氨基酸序列
• 附录3 11份香蕉种质抗病基因相关序列差异