论文摘要
高密度发酵是近年来发酵工业的重要研究方向之一。通过选育优良菌种,研究酒精酵母的高密度培养和发酵技术,提高酵母的酒精耐受性,降低产物或高渗透压底物对酵母发酵的毒害和抑制作用,提高酒精生产效益,对加快燃料酒精的产业化进程,推进绿色能源替代和国家能源安全,减少环境污染具有重要意义。本文通过选择优良菌种,采用恒速和分批补料流加培养方式,优化工艺条件实现了发酵液中较高的细胞密度和单位体积酒精产量;同时对高密度酵母酒精耐受性能、发酵性能和循环使用性能进行实验研究。本论文的主要工作和研究成果如下:（1）对酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiaeAs2.458进行摇瓶分批培养,在最适生长条件(摇床转速150rpm,温度28℃,初始糖浓度40g·L-1,甘氨酸浓度3g·L-1)下,菌体密度达到9.01g·L-1。发酵糖浓度为250 g·L-1的木薯糖化液,生产酒精浓度达到11.7%,比普通酵母浓度发酵生产酒精浓度提高24.5%。实验结果表明提高发酵液酵母浓度,可显著提高发酵酒精浓度和单位体积酒精产量。但酿酒酵母酒精耐受性以及酒精致死量偏低,在酒精浓度为10%时不能正常生长和发酵代谢,菌株作为工业酒精发酵菌种需要进一步改良。（2）通过分批、分批补料流加和连续恒速流加培养策略培养絮凝酒精酵母菌Saccharomyces cerevisiae4-S。结果显示,分批补料流加或连续流加(流加速率0.133g·L-1·m-1)有利于酒精酵母菌S.cerevisia4-S的快速生长和得到较高的细胞浓度,分批补料流加或连续流加培养44h,发酵液中酒精酵母细胞浓度（DCW）分别达到71.82g·L-1和82.01g·L-1,比分批培养分别提高了155.68%和191.95%,获得了较高的酒精酵母细胞浓度。（3）对高密度酵母酒精耐受性能考察,结果显示高密度酵母可耐受12%（v/v）胞外酒精;菌体于30℃,18%（v/v）酒精冲击2h的细胞存活率为42%。发酵培养基中添加3g·L-1甘氨酸、0.5g·L-1（NH4）2SO4和2.6g·L-1KH2PO4能有效提高菌体的酒精耐受性能,18%（V/V）酒精冲击2h的细胞存活率提高到57%。（4）利用Plackett-Burman实验设计确定了影响高密度酵母发酵性能的关键因素分别为糖浓度和胞外酒精浓度,响应面分析法优化两影响因素得出极值点分别为350g·L-1和11.6%（v/v）,通过验证性实验证实了模型的有效性。对优化后高密度酵母发酵性能的研究,结果显示酵母发酵糖浓度为350 g·L-1发酵液生产酒精浓度达到16.23%,发酵时间比普通酵母浓度批发酵时间缩短12h,酒精浓度提高24.4%。（5）对高密度酒精酵母进行循环酒精发酵实验,结果显示,前四批次生产的酒精浓度保持在13%以上,显示出良好的可重复循环发酵能力;第五批次后酵母重复利用发酵生产酒精的能力呈明显下降趋势。经过活化的酒精酵母进行循环酒精发酵,前七批次发酵液中酒精浓度保持在13%以上,第八批次后生产酒精浓度明显下降,说明中间活化对酒精酵母的重复循环发酵能力具有增强作用,但这在一定程度上增加了酒精发酵的成本,选择酒精酵母直接循环利用四次更经济。